粪菌移植构建人源化菌群小鼠的分析探讨

来源：公众号（无菌动物）

利用无菌小鼠进行人源化菌群移植构建人源化菌群小鼠模型（HFA小鼠）是一种研究人类肠道菌群和人类健康或疾病关系的一个良好模型。然而现有的粪菌悬液制备、粪菌移植（FMT）及人源化菌群小鼠构建的实验方法并没有统一的标准，其中很多的实验方法存在着一些弊端，例如粪便样本的处理时间较长、粪菌悬液制备过程中空气的暴露等，这导致样本中微生物活性受损，在这种条件下HFA小鼠并不能很好的模拟人类菌群。因此在构建HFA小鼠模型时，应尽快完善从粪样供体筛选、收集、粪菌悬液制备到菌群移植的标准操作，实现这一过程的流程化、质控化、标准化，完善人源化菌群移植相关工作，这将为模拟人类肠道菌群提供更好的动物模型。本文对多个文章报道的粪菌悬液制备及HFA小鼠模型构建的方法进行汇总，并对其中一些干扰因素进行探讨，以期有益于粪菌悬液制备、HFA小鼠模型构建的标准化。

关键词

粪便样本；粪菌悬液；FMT；人源化菌群小鼠

前言

       HFA小鼠为人类肠道菌群的研究提供了一个很好的体内模拟, 它克服了人体实验的各种不确定性因素，如遗传、环境和饮食因素等问题（HIRAYAMA K et al., 2005）。然而，Hintze KJ 等人研究报道了受体小鼠的肠道菌群与人类供体的肠道菌群存在显著差异（Hintze KJ et al., 2014）。其中粪便移植的不同技术方法对HFA小鼠对人类菌群的重现性有着较大的影响（Amir A et al., 2017）。

    此外，在应用粪菌移植治疗相关疾病时也受这些制备方法的影响。粪便菌群移植（粪便微生物从供体向患者的转移，FMT）已成为治疗艰难梭菌反复感染的极其有效的疗法（ Lessa FC et al., 2015；Van Nood E et al., 2013）。粪便移植也有望用于治疗其他胃肠道疾病，例如炎症性肠病和肠易激综合症，甚至与肠道微生物群有关的系统性疾病，例如肥胖症( Borody TJ et al., 2012；David LA et al., 2014)。然而，粪便微生物群移植的最大挑战之一是治疗或者移植 “材料”的可变性，其源于生物学变异和样品处理引起的改变。与药物不同，人的粪便（其微生物和化学成分）在人与人之间以及同一人的样品之间差异很大，并且许多疾病都与特定的微生物和粪便中的化学物质有关，（ Human Microbiome Project Consortium; David LA et al., 2014 ）。因此，在粪菌移植过程中，样品制备的不当操作可能会导致这些微生物出现变异影响治疗效果，甚至出现不良事件。

    同样，在构建HFA小鼠时，粪菌悬液样品制备的不当操作会导致供体微生物与定植在接受移植的的小鼠的微生物组成存在较大的差异，这可能会导致HFA小鼠并不能很好地反映出供体粪便微生物与人类健康或疾病的关系。因此，标准化HFA小鼠制备过程中的粪样供体筛选、收集、粪菌悬液制备到菌群移植工作，是非常必要的！本文汇总了粪菌移植实验的一些方法，并总结了模型构建及实验目的可能的影响因素，提出粪菌悬液制备过程中需要注重的操作的核心观点，旨在于为HFA模型可以更好的模拟人的肠道菌群，应用于人类健康研究。

HFA小鼠构建方法的汇总探讨

    结合文献报道，从供体筛选、粪便样品收集、粪菌悬液制备和FMT 到HFA小鼠的方法，进行汇总：

    Li, B等人为研究重度抑郁症（MDD）的肠道菌群移植到无菌小鼠后对动物代谢的影响，利用无菌小鼠接种MDD患者粪便菌群，首先使用DSM-IV-TR标准和汉密尔顿抑郁测量表中的17项与患者进行结构性精神病学访谈后，诊断出MDD患者。通过在无氧环境下从五个MDD或健康个体中随机选择0.5 g粪便来进行FMT，并将所有0.5 g样品混合在7.5 mL的0.9％盐水中以得到悬浮液。然后，从第三军医大学实验动物研究中心获得了6周龄重30–40 g的昆明无菌小鼠（饲喂于隔离器）。在实验开始之前，使小鼠适应标准实验条件2周。将粪菌悬液通过柔性膜隔离器移植到无菌小鼠体内。2周后，进行行为学测试，之后立即收集小鼠的相关样品，并将其储存在-80°C下直至进行分析（Li, B et al., 2018）。

    Zheng P等人为研究精神分裂症（SCZ）与肠道菌群的关系，随机选择的5名SCZ患者(男性，PANSS评分，67至81岁)和5名健康对照（HCS） 的粪便样本(即肠道微生物群)，代表了他们各自的完整种群分布（通过测序获得的实验样本，可以很好的代表SCZ或HC的菌群结构），用于5~6周龄昆明种小鼠(GF小鼠)的定植(实验动物饲养条件见Li, B et al., 2018）。简而言之，粪便样品用无菌磷酸盐缓冲盐水(15ml/g粪便)悬浮，每组等体积混合，然后将这些用于接种的物样品涡旋5分钟，静置5分钟以沉淀颗粒。每只GF小鼠灌胃200μl来自SCZ患者或HCS的粪便悬浮液。在FMT后，小鼠处于悉生生物环境中，与以前的饲养条件相同。最后，在微生物群移植后2周，对小鼠进行行为学测试。（Zheng P et al., 2019）。

    Wong SH等人为探索大肠癌患者粪便微生物对无菌小鼠的影响，将大肠癌患者的粪便样本移植到无菌小鼠身上进行了实验研究。首先是人类粪便样本收集，使用的粪便样本之前已经被测序，用于全基因组范围的关联研究。供体接受结肠镜检查的成年人，包括出现消化症状(如排便习惯改变、直肠出血、腹痛或贫血)的个人提供实验组样本，以及接受筛查结肠镜检查的≥50岁的无症状个人作为健康对照样本，为无菌小鼠灌胃备用。要求受试者在家中将粪便样品收集在标准化容器中，并将样品立即存储在其家用冷冻柜中，冷冻样品被送入实验室的聚苯乙烯泡沫绝缘容器中，并在-80°C下储存立即使用。为准备灌胃粪菌悬液，随机抽取大肠癌患者和健康人各5份粪便，等重混合。然后将1g混合粪便悬浮在5mL PBS中。使用200µL的等量悬浮液灌胃到每只小鼠。无菌的C57BL / 6小鼠饲养条件见(Li B et al., 2018)。将成年小鼠（8周龄）随机分为2组，（每组8只雄性和7只雌性），并用大肠癌患者粪便（CRC-G）或健康对照（HC-G）患者的粪菌悬液灌胃，对照是同窝的无菌鼠。对无菌小鼠进行1次(第0周)粪便样品灌胃，每组随机抽取5只小鼠，分别于灌胃后8周、20周、32周处死。实验结果发现，大肠癌患者粪便悬液灌胃促进无菌小鼠肠道癌变（Wong SH et al., 2017）。

    Chen Y等人为研究长寿与肠道微生物的关系，基于无菌小鼠移植长寿老人的粪便微生物。首先选取两名健康的101岁老人的粪便作为实验组，对照组为70岁健康老人的粪便。在志愿者家中收集粪便，并放入无菌的粪便收集管中，然后24小时内利用冰盒转移到实验室，并立即在-80℃条件下保存。简而言之，通过在厌氧条件下在含15％甘油（v / v）的10mL PBS中稀释1g冷冻的人粪便样品用来制备悬浮液。然后将混合的材料涡旋悬浮，并分装储存在-80°C，每天一次通过灌胃法给小鼠0.2mL粪便悬浮液，持续2周，最后发现长寿老人的粪菌移植到GF小鼠可以减少与衰老相关的指标及与之相关的益生菌（Chen Y et al., 2020）。

    从这几种HFA小鼠构建方法来看，无外乎粪便样本收集的冷冻、无菌条件下粪菌悬液制备、甘油冷冻保护等，但是也有一些其他影响HFA小鼠菌群的因素值得探索。

HFA小鼠肠道菌群的影响因素探讨

    从供体筛选到HFA小鼠的菌群定植过程中，可能影响HFA小鼠菌群组成的因素有很多。如粪便样本收集后的处理、粪菌悬液制备方法及过程中的厌氧处理、粪菌悬液的保存、HFA小鼠的饮食等多种因素影响着HFA小鼠菌群的定植状况。

1）粪便样本的收集后的处理

    在室温下短时间保存样品对于样品收集程序很重要，因为这样供体有机会独自完成样品的采集。为了确定在冻结之前粪便在室温下可放置多久而又不影响下游DNA检测的完整性，Gorzelak MA分析了在室温下放置15或30分钟的粪便样本，实验发现，在室温下储存30分钟后，相对于在室温下储存15分钟，肠道的主要类群的细菌，Bacteroidetes 和 Firmicutes存在显着差异。这些结果表明粪便样本应在排便后尽可能在15分钟内冷冻(Gorzelak MA ., 2015)。

图1：室温条件下时长对微生物的影响

图片来源于：PLOS One

2）粪菌悬液制备方法

    实验室准备对FMT的成功至关重要，可分为“粗过滤(RF)”、“过滤加离心(FPC)”、“微滤加离心(MPC)” 。例如，Hamilton MJ 2012年报告中的方法可称为FPC (Hamilton MJ et al., 2012)，而使用基于GenFMTer的净化系统的自动方法(FMT Medical，南京，中国) 可称为MPC(He et al., 2017)，该方法可提高实验室过程的标准化并避免技术人员接触粪便.

    Chu ND等人的研究发现，目前制备粪菌悬液的的一些实验操作对活的粪便微生物含量有着不利影响（Chu ND et al., 2017）。但实际上，这些手工制备悬液的方法准备通常在六小时内完成即“六小时FMT协议” (Cammarota et al., 2017)。通过自动净化系统和实验室技术人员与临床医生的密切合作，Zhang F等人将“从排便到输送”或“从排便到冷冻”的时间缩短至一小时(Cui et al., 2016; Cammarota et al., 2017)。这极大地提高了FMT的疗效，也为HFA小鼠模型构建提供了启发。

3）粪菌悬液制备过程中厌氧处理

    已知大多数物种都是专性厌氧菌，但当前的许多用于FMT治疗的粪菌悬液制备的标准做法涉及需氧，暴露于氧气会改变粪便细菌的生存力。Chu ND等人的研究发现，氧气暴露降低了粪便细菌群落，值得注意的是，Faecalibacterium prausnitzii (一种抗炎共生细菌，其缺失与炎症性肠病有关)的丰度随着氧气暴露而减少。因此在利用HFA模型研究炎症性肠病与微生物关系时，厌氧处理对研究尤为重要。（Chu ND et al., 2017）。

4）粪菌悬液的冻融及滞后时间

    Chu ND等人的研究结果表明，适量的冻融循环和适度的滞后时间对粪便微生物群落的改变不像在均质化过程中暴露于氧气那样多，并且实际上可能不会极大地影响治疗应用到病人的FMT效果(Chu ND et al., 2017)。

    为了确定解冻和重新冷冻样品的菌群活性效果，Gorzelak MA的研究在连续四个完整的冻融循环后测试了细菌类群的丰度。首先将样品均质化，以确保冻融处理产生检测到的变化，而不是未均质粪便样品中的固有变化。将每个样品解冻七分钟，然后在液氮中速冻完成一个循环。实验结果发现仅在四个周期的冻融循环后，检测到Enterobacteriaceae增加，而Bacteroidetes减少（出现显著变化）。值得注意的是，当融化周期超过十分钟时，作者发现数据的差异更大。总的来说，这些结果表明粪便样品可以冷冻融化多达四次。（Gorzelak MA et al., 2015）

5）HFA小鼠的饮食

    HFA小鼠也已用于研究与人类微生物组有关的基本生态问题。在最近的研究中，Sonnenburg等人以HFA小鼠为模型，研究了低微生物群可利用的碳水化合物（MACS）（占微生物群能量的很大一部分）饮食,对几个宿主世代中肠道菌群多样性的影响（Sonnenburg et al., 2016）。这项研究表明，低MAC饮食会导致大量OTU的数量急剧减少，一旦重新引入高MAC饮食，其中只有一半会恢复。到第四代小鼠时，几乎所有拟杆菌的OTU都消失了。这项研究具有开创性，因为它为微生物组消耗的生态因素（饮食）提供了第一批经验证据。

    Turnbaugh PJ的研究表明，对人源化菌群小鼠的宏基因组学分析显示，在成年小鼠中，当动物从小鼠食物转换为西方饮食时，定植的肠道微生物组成会在数小时的时间内发生巨大变化（Turnbaugh PJ et al., 2009）。

因此，当进行人类微生物群的生态研究（例如饮食对微生物群多样性的影响）时，具有自身适应微生物群的常规小鼠是研究人类微生物群相互作用的良好对照模型，因为人类也拥有适应微生物群（Arrieta MC., 2016）。

图2：影响HFA小鼠定植的菌群种类因素

讨论

    在构建HFA小鼠时，很多研究在介绍实验方法时避重就轻，仅仅简单的列出粪菌悬液的制备与移植方法，但并没有具体到很多实验细节，例如悬浮粪便的溶液有没有无氧预还原、是否在无氧条件下制备、接种的细菌量、接种的次数、细菌定植的周期、饲喂HFA小鼠的营养成分等等，而实际上这些条件都有可能影响最终的实验结果，因为有时候可能人类肠道的功能菌只是一小部分，但却可能发挥着重要的生理学功能，却可能因为没有标准化的实验流程造成了这些菌的丢失或失活。因此本文建议，随着这一领域研究的深入，标准化的粪菌移植、HFA小鼠模型构建方法应尽早建立。此外，还应搭配代谢组学，转录组学或蛋白质组学或其他方法对构建后的HFA小鼠粪便测序进行补充，进行功能评估移植的微生物群。（Arrieta MC., 2016）。

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