《阿特珠单抗联合贝伐单抗治疗晚期肝细胞癌的临床反应及耐药的分子相关性》·文献精读

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https://www.nature.com/articles/s41591-022-01868-2

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一、摘要

本研究内容讨论了对接受阿特珠单抗联合贝伐单抗、阿特珠单抗单药或索拉非尼治疗的肝细胞癌（HCC）患者的肿瘤样本进行的综合分子分析。以下是对要点的总结和分析：

试验参与者

**358名**HCC患者参加了GO30140 1b期或IMbrave150 3期试验，并接受了atezolizumab联合贝伐珠单抗、atezolizumab单药或索拉非尼的治疗。

既往免疫

CD274（PD-L1）的高表达、T-效应特征以及瘤内CD8+T细胞的高密度与联合疗法更好的临床疗效有关。这表明，对肿瘤已有免疫反应的患者可能从联合疗法中获益更多。

降低临床获益

调节性T细胞（Treg）与效应T细胞（Teff）比例高以及胎盘上基因（GPC3、AFP）的表达与联合疗法的临床获益减少有关。这表明，调节性T细胞比例高或具有某些遗传标记的患者可能对治疗反应不佳。

联合疗法与单用阿特珠单抗相比

与单用阿特珠单抗相比，联合疗法的疗效改善与血管内皮生长因子受体2（KDR）、Tregs和骨髓炎症特征的高表达有关。这表明，在atezolizumab（抗PD-L1）的基础上加用贝伐珠单抗（抗血管内皮生长因子），可通过靶向血管生成、Treg增殖和骨髓细胞炎症提高疗效。

验证

通过分析治疗前后的配对活检组织、**原位分析**和体内小鼠模型，进一步验证了研究结果。

反应和抵抗的机制

该研究强调，抗血管内皮生长因子疗法可通过针对肿瘤生物学的不同方面（如血管生成、Treg增殖和髓细胞炎症）与抗PD-L1协同作用。

总之，这项研究深入揭示了HCC患者对阿特珠单抗联合贝伐单抗疗法的反应和耐药性的分子相关性。它确定了可能预测治疗结果的特定免疫和遗传标记物，并提出了联合疗法发挥作用的潜在机制。这些发现有助于更好地理解免疫系统、肿瘤和治疗之间复杂的相互作用，并有助于指导未来的HCC治疗策略。

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二、引言

本研究内容提供了有关肝细胞癌（HCC）及其治疗现状的背景信息，以及最近批准的一种新的联合疗法。以下是对要点的总结和分析：

肝细胞癌统计数据

肝细胞癌是全球第六大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的第三大原因。这凸显了该疾病对公众健康的重大影响。

历史治疗方案

直到最近，索拉非尼和仑伐替尼等抗血管生成多激酶抑制剂仍是不可切除的HCC患者的一线系统疗法。针对PD-1-PD-L1轴的免疫检查点抑制剂（ICIs），如atezolizumab，已被批准作为二线疗法。

治疗进展

Atezolizumab联合贝伐单抗（分别抗PD-L1和抗VEGF）在最初的1b期研究和随后的3期随机研究（IMbrave150）中显示出良好的抗肿瘤活性和可耐受的安全性。因此，它被批准作为既往未接受过系统治疗的不可切除HCC患者的新治疗标准。

其他癌症的联合疗法

在针对非小细胞肺癌（NSCLC）和肾细胞癌（RCC）的2/3期研究中，ICIs与抗血管内皮生长因子（anti-VEGF）的联合治疗与标准治疗相比，临床疗效有类似的改善。

未满足的医疗需求

尽管有这些治疗方案，但无法切除的HCC患者仍有大量医疗需求未得到满足，且预后较差，这表明需要进一步研究和开发有效的疗法。

研究目标

本研究旨在**确定潜在的候选生物标志物，以预测阿特珠单抗+贝伐珠单抗联合疗法的反应和耐药性**。该研究还试图从机理上揭示抗血管内皮生长因子如何增强抗PD-L1免疫疗法。

总之，报告内容概述了目前治疗HCC的情况以及最近批准的阿特珠单抗+贝伐珠单抗联合疗法，为研究奠定了基础。它强调了对预测性生物标志物的需求，以及深入了解这种疗法改善HCC患者预后的机制。

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三、结果

3-1：阿特珠单抗-贝伐珠单抗临床反应的分子相关性

本研究内容讨论了肝细胞癌（HCC）患者对阿特珠单抗+贝伐单抗临床反应的分子相关性。以下是对要点的总结和分析：

研究队列

该研究以GO30140 1b期研究（n=90）的数据作为初始发现队列，以IMbrave150研究（n=177）的数据作为进一步确认和探索的第二个队列。

临床数据代表性

用于生物标记物关联分析的临床数据基于两项试验的主要分析。生物标志物有价值人群（BEP）的人口统计学特征和基线特征与意向治疗人群（ITT）的人口统计学特征和基线特征基本一致。在发现队列和验证队列中，BEP的临床结果也代表了ITT群体的临床结果。

反应的基因组相关性

**全基因组差异表达基因（DEG）分析**发现，代表原有抗肿瘤免疫力的多个基因是与阿特珠单抗+贝伐珠单抗应答相关的首要特征。标志基因组富集分析（GSEA）证实，适应性免疫和先天性免疫通路与反应相关。血管生成、胆固醇稳态、胆汁酸代谢和缺口信号通路与无应答相关。

免疫细胞亚群与反应

该研究利用xCell解卷积分析观察到，包括**CD8和CD4 T细胞、Tregs、B细胞和树突状细胞在内的多个免疫亚群的大量存在与更好的反应和更长的无进展生存期（PFS）相关**。

ABRS反应特征

atezolizumab+贝伐单抗反应特征**（ABRS）是由DEG分析中的前十个基因和代表这些通路/关键免疫亚群的策划特征得出的。与病情稳定或进展的患者相比，完全或部分应答患者的ABRS和代表原有免疫的基因或特征一直较高**。*

分子特征的临床相关性

ABRS、CD274（PD-L1信使RNA）或Teff特征（CXCL9、PRF1和GZMB）高表达的患者在接受阿特珠单抗+贝伐珠单抗与索拉非尼治疗时，PFS和总生存期（OS）更长。*

多变量分析

多变量分析证实，ABRS、CD274或Teff特征高表达的患者接受atezolizumab+贝伐珠单抗与索拉非尼治疗时，PFS和OS均有所改善。

局限性

IMbrave150研究中的BEP样本量有限（占ITT的35%），但研究结果证实，这些生物标志物与临床结果相关，可作为有希望的候选生物标志物，用于识别阿特珠单抗+贝伐珠单抗比索拉非尼更有益的患者。

总之，该研究确定了与HCC患者对阿特珠单抗+贝伐珠单抗的临床反应或耐药性相关的潜在生物标志物。结果表明，与索拉非尼相比，ABRS、CD274或Teff特征高表达的患者可能从联合疗法中获益更多。这项研究有助于深入了解这种疗法改善HCC患者预后的分子机制。

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3-2：原位验证临床反应的分子相关性

本研究内容讨论了肝细胞癌（HCC）患者对阿特珠单抗+贝伐单抗临床反应的分子相关性的**原位验证**。以下是对要点的总结和分析：

免疫组化（IHC）分析

通过IHC对GO30140研究的180例患者和IMbrave150研究的199例患者进行了**PD-L1蛋白表达评估。尽管观察到随着PD-L1 IC/TC评分的增加，确诊客观反应率（ORR）呈上升趋势**，但该趋势在两项研究中均未达到统计学意义。

肿瘤微环境（TME）中的分子特征

开发了两组五联IHC检测，以评估来自GO30140 armA队列的61份基线肿瘤样本中的TME。

1. 面板1（HepPar 1/Arginase 1-FAP-CD31-CD8-MHC class I）评估了肿瘤-免疫-基质背景
2. 面板2（HepPar 1/Arginase 1-CD3-PD-1-PD-L1-GranzymeB）描述了T细胞的功能状态。

与基因组研究结果一致，与无应答者（病情稳定或进展）相比，应答者（完全应答或部分应答）肿瘤区域的浸润性CD8+ T细胞、CD3+ T细胞和GZMB+CD3+ T细胞密度更高。在应答者中还观察到肿瘤细胞和免疫细胞中有**更高的PD-L1蛋白表达，但并不显著**。与非应答者相比，应答者肿瘤细胞表面的MHC I类表达更高。

IMbrave150研究的原位分析

对IMbrave150研究中177份基线肿瘤样本中肿瘤浸润CD8+ T细胞的密度进行了分析。与索拉非尼相比，atezolizumab+贝伐单抗治疗瘤内CD8+ T细胞密度高的患者总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）更长。

总体研究结果

GO30140和IMbrave150研究的原位分析表明，已有免疫力的患者使用atezolizumab+贝伐单抗似乎能改善临床预后。

总之，该研究进一步证明，肿瘤微环境中的某些分子特征，如较高密度的CD8+ T细胞、CD3+ T细胞和GZMB+CD3+ T细胞，与接受阿特珠单抗+贝伐珠单抗治疗的HCC患者较好的临床预后相关。这些发现与基因组分析结果一致，支持将这些特征作为预测治疗反应的生物标志物。

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3-3：阿特珠单抗+贝伐珠单抗临床耐药性的分子相关性

本研究内容讨论了**肝细胞癌（HCC）患者对阿特珠单抗+贝伐单抗临床耐药的分子相关性**。以下是对要点的总结和分析：

抗药性的候选生物标志物

GO30140 armA研究的**全基因组差异表达基因（DEG）分析发现了几个与阿特珠单抗+贝伐珠单抗无应答**相关的候选生物标志物。研究发现，NOTCH通路激活的转录靶基因HES1的高表达可能与疾病进展和较短的无进展生存期（PFS）相关。然而，IMbrave150研究并未证实HES1高表达与疾病进展有关。

通路和免疫亚群

全基因组基因组富集分析（GSEA）和xCell分析确定了与缺乏反应相关的通路和关键免疫亚群。对IMbrave150研究中177个基线肿瘤组织的转录组数据进行分析后发现，Treg/Teff特征的低比例与阿特珠单抗+贝伐单抗与索拉非尼相比改善的PFS和总生存期（OS）有关。

AFP和GPC3的生物标志物

在IMbrave150研究中，评估了AFP和GPC3这两个公认的HCC特异性生物标志物与临床结果的关系。GPC3和AFP高表达的患者使用阿特珠单抗+贝伐单抗与索拉非尼相比，治疗效果较差。在使用atezolizumab+贝伐单抗与索拉非尼治疗时，低表达这些标志物的患者的PFS较长，而高表达患者的PFS与索拉非尼相似。尽管如此，这些生物标志物高表达的患者在接受联合治疗与索拉非尼相比，仍显示出良好的OS危险比（HR），尽管在生物标志物低表达的人群中观察到了更大的OS治疗获益。

总之，该研究发现了与HCC患者对阿特珠单抗+贝伐单抗耐药相关的潜在分子特征。有关HES1表达和Treg/Teff比率的研究结果与基因组分析结果一致，而与AFP和GPC3表达的关联则更为复杂，对治疗结果既有预测作用，也有非预测作用。要全面了解这些生物标志物在预测阿特珠单抗+贝伐单抗治疗反应中的作用，还需要进一步的研究。

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3-4：肿瘤突变与临床结果的关系

本研究内容讨论了接受阿特珠单抗+贝伐单抗治疗的**晚期肝细胞癌（HCC）患者的肿瘤突变与临床预后的关系**。以下是对要点的总结和分析：

肿瘤突变负荷（TMB）和新抗原负荷

肿瘤突变负荷（TMB）和新抗原负荷与其他类型癌症免疫疗法临床疗效的改善有关。然而，它们对晚期HCC免疫疗法反应的影响还不太明确。

突变谱分析

对来自GO30140 armA研究的76份患者匹配的肿瘤-血液样本和来自IMbrave150研究的130份基线肿瘤样本进行了**全外显子组测序（WES）**或FoundationOne panel分析。WES评估的TMB中位数为每兆碱基（Mb）5.6个突变，FoundationOne评估的TMB中位数为每兆碱基4.4个突变。

TMB与反应的关系

在GO30140 armA研究中，与低TMB（三等分1）或中等TMB（三等分2）患者相比，高TMB（三等分3）患者的独立审查机构（IRF）评估的客观应答率（ORR）更高。与低或中TMB患者相比，高TMB患者的无进展生存期（PFS）有延长的趋势，但不明显。在IMbrave150研究中，阿特珠单抗+贝伐单抗组的TMB与反应率或生存获益之间没有明显关联。

新抗原负荷与反应的关系

在GO30140 armA研究中，新抗原载量与应答之间无明显关联。

HCC的突变情况

IMbrave150研究中入选的HCC患者的突变情况证实了频繁发生的疾病相关体细胞突变，包括TERT启动子突变（56.2%）、CTNNB1（37.7%）、TP53（36.2%）、ARID1A（19.2%）、RB1（12.3%）和MYC基因扩增（15.4%）。

临床结果与突变状态的潜在关联

对几个经常发生突变的基因（本研究中≥10%的BEP）进行评估，发现CTNNB1和TERT启动子的突变状态与临床结果有潜在关联。野生型CTNNB1患者接受阿特珠单抗+贝伐单抗治疗的疗效优于索拉非尼，这似乎主要是由于索拉非尼治疗组中CTNNB1突变体对预后的积极影响。与TERT野生型肿瘤患者相比，atezolizumab+贝伐单抗在TERT突变型肿瘤患者中的获益更为明显。

局限性

由于这些分析的样本量有限，需要进一步验证这些发现。

总之，本研究为阿特珠单抗+贝伐单抗治疗的HCC患者提供了肿瘤突变与临床预后相关性的见解。虽然TMB和某些基因突变与临床预后有潜在的关联，但还需要更大样本量的进一步研究来证实这些发现。

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3-5：阿特珠单抗+贝伐单抗与阿特珠单抗疗效的分子相关性

内容讨论了肝细胞癌（HCC）患者接受阿特珠单抗+贝伐单抗与阿特珠单抗单药治疗的分子相关性。以下是要点总结和分析：

1. 研究队列： GO30140 F组是一个随机分组，比较了阿特珠单抗+贝伐单抗与阿特珠单抗单药治疗。
2. 生物标志物分析： 目的是深入了解atezolizumab+贝伐单抗的潜在作用机制（MOA），尤其是抗血管内皮生长因子如何增强抗PD-L1的抗肿瘤活性。
3. 转录组分析： 对44例阿替珠单抗+贝伐单抗治疗组患者和47例阿替珠单抗单药治疗组患者的基线肿瘤组织进行转录组分析。
4. 全基因组差异表达基因（DEG）和基因组富集分析（GSEA）： 这些分析没有发现与两个治疗组临床结果差异相关的任何单个基因或通路。
5. x细胞解卷积分析： 这项分析确定了几个免疫亚群，包括 CD8+ T 细胞、Tregs 和巨噬细胞，与贝伐珠单抗增加的临床获益相关。
6. 基因特征： 该研究利用Teff、Treg和骨髓炎症的策划基因特征，证实这些免疫亚群与阿特珠单抗+贝伐珠单抗与阿特珠单抗单药治疗无进展生存期（PFS）的改善有关。
7. VEGFA 和血管内皮生长因子受体 2 (KDR) 表达： KDR的高表达与贝伐珠单抗的额外获益相关，但与VEGFA无关。这表明，抗血管内皮生长因子可增强抗 PD-L1 的抗肿瘤活性，至少部分是通过抑制肿瘤血管生成。
8. 治疗前与治疗后肿瘤活检： 对14例患者匹配的治疗前与治疗后肿瘤活检的分析表明，无论临床反应如何，阿特珠单抗+贝伐单抗治疗后KDR表达普遍下降。对于Treg特征，atezolizumab单药治疗和atezolizumab+贝伐珠单抗治疗均可降低其表达，但atezolizumab+贝伐珠单抗治疗组应答者的表达降低幅度更大。
9. 血管密度与临床结果： 对来自armF队列的86个基线肿瘤进行的多重IHC面板分析表明，基线肿瘤中血管密度高与阿特珠单抗+贝伐单抗与阿特珠单抗单药相比更长的PFS相关。
10. 机制启示： 研究结果表明，抗血管内皮生长因子可通过靶向血管内皮生长因子介导的血管生成、Treg增殖和髓系细胞炎症，增强抗肿瘤免疫力并加强抗PD-L1免疫疗法。

总之，这项研究为阿特珠单抗+贝伐珠单抗在HCC患者中改善疗效的分子机制提供了新的见解。研究结果强调了免疫亚群、血管内皮生长因子相关通路和血管生成在增强联合疗法疗效方面的潜在作用。

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3-6：阿特珠单抗+贝伐单抗在 HCC 小鼠模型中的应用

本研究内容探讨了利用小鼠肝细胞癌（HCC）模型研究阿特珠单抗（抗PD-L1）和贝伐珠单抗（抗VEGF）联合疗法的**作用机制（MOA）**。以下是对要点的总结和分析：

鼠类HCC模型

该模型由MYC过度表达和β-catenin（CTNNB1）激活驱动，这使其对抗病毒-PD-1免疫疗法产生抗药性。使用抗-PD-L1和抗血管内皮生长因子治疗4周后，小鼠的存活率显著提高，出现肿瘤的小鼠比例也有所下降。与单药治疗相比，抗-PD-L1/抗-VEGF双重治疗（联合疗法）显示出更强的生存优势。

免疫细胞群

治疗2周后，与对照组或单独抗血管内皮生长因子治疗组相比，联合治疗组的CD8+ T细胞总数和增殖细胞（Ki67+）显著增加。增殖（Ki67+）和表达GZMB（Gzmb+）的抗原特异性（SIINFEKL+）CD8+ T细胞的数量在联合组中都明显增加。总的和增殖的Foxp3+CD4+ Tregs在抗PD-L1治疗后明显增加，但与抗PD-L1组相比，联合组有减少的趋势。联合组显示增殖Tregs在Treg总群中所占的比例显著下降，这表明抗血管内皮生长因子在减少Treg增殖方面发挥了作用。与抗PD-L1组相比，联合组的常规树突状细胞（cDCs；MHC IIhiCd11chi）数量明显增加，但单核细胞衍生巨噬细胞（MoMa；F4/80intLy6chi）数量明显减少。

血管和免疫细胞密度

免疫组化（IHC）显示，抗血管内皮生长因子治疗组与对照组相比，通过内黏蛋白染色测量的每平方毫米肿瘤和肿瘤周围区域的血管数量显著减少。与药物或抗VEGF相比，联合治疗组每平方毫米肿瘤周围的CD8+ T细胞数量明显增加。

结论

综合临床和临床前实验证明，抗血管内皮生长因子可通过靶向血管内皮生长因子介导的血管生成、髓样细胞存在和Treg增殖，增强抗肿瘤免疫力，提高抗PD-L1免疫疗法的效果。

总之，小鼠HCC模型研究提供了证据，证明阿特珠单抗+贝伐单抗联合疗法可以通过调节各种免疫细胞群和肿瘤微环境来增强抗肿瘤免疫和免疫疗法。研究结果支持了临床发现，即联合疗法中的抗血管内皮生长因子成分通过靶向血管生成和Treg增殖促进了整体疗效。

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四、讨论

内容讨论了血管生成（新血管的形成）和免疫逃避（癌细胞逃避免疫系统检测的能力）在肿瘤发生和发展过程中的相互依存关系。内容强调，肿瘤细胞可利用这些过程促进其生长和扩散。临床前研究表明，血管和免疫细胞在肿瘤微环境（TME）中的动态相互作用非常重要，这为结合针对肿瘤血管生成和免疫逃避的免疫疗法提供了理论依据。

在临床上，抗血管生成疗法与免疫检查点抑制剂（ICIs）的结合在治疗各种癌症方面取得了重大突破，包括转移性非鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）、晚期肾细胞癌（RCC）、子宫内膜癌和肝细胞癌（HCC）。

该研究利用转录组学、遗传学和免疫组化技术分析了参加临床试验的 HCC 患者的肿瘤样本。研究的核心发现是，基线肿瘤组织中预先存在的免疫似乎推动了阿特珠单抗（一种抗PD-L1检查点抑制剂）和贝伐珠单抗（一种抗血管内皮生长因子抗体）联合疗法的临床活性。PD-L1表达、炎症生物标志物和炎症基因特征与晚期HCC患者生存率的提高和对免疫疗法的反应有关。

研究还发现了联合疗法获益减少的潜在分子相关因素，包括调节性T细胞（Tregs）与效应T细胞（Teffs）的高比例，以及甲胎蛋白（AFP）和糖蛋白-3（GPC3）等胎盘上基因的高表达。这些因素与 HCC 的免疫抑制和疾病进展有关。此外，研究还发现，与野生型患者相比，TERT启动子突变的患者在接受联合疗法后，临床疗效得到了更多改善，而CTNNB1突变患者的临床疗效改善较少。这表明，这些基因的突变状态可能会影响不同疗法对 HCC 的疗效。

总之，这项研究强调了了解肿瘤的分子和免疫状况对于为癌症患者开发更有效的联合免疫疗法的重要性。

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内容讨论了非酒精性脂肪性肝炎（NASH）驱动的肝细胞癌（HCC）对免疫疗法的反应，尤其是阿特珠单抗和贝伐珠单抗的联合疗法。最近的一项研究表明，由于存在免疫耗竭的CD8+/PD-1+细胞，这种形式的HCC可能对免疫疗法反应不佳。然而，本研究对IMbrave150试验数据的分析表明，非病毒性（包括NASH）HCC组与病毒性HCC组在生存获益上的明显差异可能是由于非病毒组服用索拉非尼后的预后出乎意料地好，而不是对阿特珠单抗和贝伐珠单抗反应的真正差异。此外，CD8A-高/PDCD1-高细胞群（CD8+/PD-1+细胞的代用指标）中的非病毒病因并不明显。事实上，在阿特珠单抗和贝伐珠单抗的治疗下，这一人群似乎有更长的无进展生存期（PFS）和更长的总生存期（OS）趋势。

这项研究还让人们深入了解了抗血管内皮生长因子疗法如何增强抗肿瘤免疫力并提高抗PD-L1免疫疗法的疗效。众所周知，抗血管内皮生长因子疗法可抑制肿瘤血管生成，但它也可能具有免疫抑制作用。研究结果表明，抗血管内皮生长因子疗法实际上可以通过减少单核细胞衍生巨噬细胞的数量、减少增殖的Tregs以及增加常规树突状细胞和CD8+T细胞的数量来增强抗肿瘤免疫力。这似乎是通过减少肿瘤和肿瘤周围区域的血管来实现的。

这项研究存在一些局限性，包括生物标志物分析的回顾性和假设生成性，组织类型、位置、年龄和既往疗法对肿瘤微环境的潜在影响，以及临床前模型无法完全再现 HCC 的临床异质性。尽管存在这些局限性，该研究仍代表了一项全面的临床转化生物标志物研究，并确定了预测抗 PD-L1 和抗血管内皮生长因子联合疗法反应和耐药性的潜在候选生物标志物。它还提供了机理方面的见解，可为新的治疗策略提供依据，从而克服抗药性并提高癌症免疫疗法在 HCC 中的临床疗效。

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五、方法

5-1：研究设计、患者和样本采集

本研究内容介绍了GO30140和IMbrave150两项临床试验的研究设计、患者入组和样本采集方法。这两项临床试验旨在研究atezolizumab（一种抗PD-L1检查点抑制剂）和贝伐珠单抗（一种抗血管内皮生长因子抗体）治疗不可切除性肝细胞癌（HCC）的疗效。

GO30140研究

一项开放标签、多中心、多臂、1b期研究，在7个国家的26个学术中心和社区肿瘤诊所进行。该研究包括**五个组别，但只有两个HCC组别（A组和F组）与本文讨论相关**。

1. 在A组中，所有**104名患者都接受了阿特珠单抗和贝伐单抗的联合治疗**。
2. 在F组中，**119名患者按1:1的比例随机分配接受阿特珠单抗和贝伐单抗治疗（60人）或单独接受**阿特珠单抗治疗（59人）。

**主要终点**是A组的客观反应率（ORR）和F组意向治疗人群的无进展生存期（PFS），均由独立审查机构根据RECIST 1.1标准进行评估。必须提交基线组织，包括入组前6个月内收集的档案组织或入组时收集的新鲜活检组织。研究中的肿瘤活检收集是可选的，大多在首次用药后2-4周进行。

IMbrave150研究

一项全球性、开放标签的三期试验，共招募了**501名之前未接受过系统治疗的不可切除HCC患者。患者按2:1**的比例随机分配接受阿特珠单抗和贝伐单抗或索拉非尼（一种多激酶抑制剂）治疗，直到出现不可接受的毒性反应或失去临床疗效。

**共同主要终点**是ITT人群的总生存期（OS）和PFS，由独立审查机构根据RECIST 1.1标准进行评估。本研究无需提交基线组织。

样本采集对两项研究中的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）肿瘤切除或小活检组织切片进行大体切片，使肿瘤比例大于50%。在GO30140中，对181个FFPE肿瘤组织进行了大切片。在IMbrave150中，对177个FFPE肿瘤组织进行了大切片。

这些研究对于了解阿特珠单抗和贝伐珠单抗治疗HCC的临床活性和生物标志物特征非常重要。肿瘤组织的收集和分析对于深入了解联合疗法反应和耐药性的分子相关性至关重要。使用FFPE组织和大切片可确保样本中的肿瘤含量足以进行精确分析，这对验证生物标记物和了解肿瘤微环境至关重要。

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5-2：遗传和表达分析

本研究内容介绍了GO30140和IMbrave150肝细胞癌（HCC）临床试验中使用的基因和表达分析方法。这些方法包括**全外显子组测序（WES）、FoundationOne面板测试、新抗原预测和RNA序列分析（RNA-seq）**。

全外显子组测序（WES）

从GO30140 A组和F组169名患者的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）切除术和小活检组织中分离基因组DNA，从全血中分离种系DNA。文库制备使用与Illumina兼容的测序文库，外显子组杂交捕获使用Agilent SureSelectXT Human All Exon v.5试剂盒。测序在Illumina HiSeq2000或HiSeq2500平台上进行，肿瘤样本的平均深度为100×，PBMC样本的平均深度为50×。使用Strelka 1.0.4和变异效应预测器检测体细胞突变，并计算肿瘤突变负荷（TMB）。

FoundationOne面板检测

在IMbrave150研究中，对130名患者进行了FoundationOne（F1CDx）测序。基因组DNA使用Omega Bio-Tek FFPE DNA提取试剂盒提取。F1CDx方法采用靶向、高通量、基于杂交的捕获技术来检测突变、拷贝数改变和基因组特征，包括TMB。

新抗原预测

通过使用VariantTools软件包分析RNA-seq比对，确定表达突变。使用NetMHCcons软件包，根据HLA基因分型和最佳HLA-neoepitope配对预测新抗原潜力。使用Polysolver对PBMCs的全外显子组数据进行HLA基因分型。

RNA-Seq

使用TruSeq RNA Access技术进行RNA序列分析。在去除核糖体读数后，将读数与人类参考基因组（NCBI Build 38）进行比对。使用edgeR和limma软件包对基因表达水平进行量化，并对原始计数进行归一化处理。

这些方法对于了解HCC的遗传图谱以及鉴定可预测治疗反应或耐药性的潜在生物标记物至关重要。WES和RNA-seq分别提供了全面的基因组和转录组数据，而FoundationOne面板则为检测相关基因改变提供了有针对性的方法。新抗原预测对于了解肿瘤的免疫反应非常重要，可用于开发个性化的免疫疗法。这些分析产生的数据有助于为HCC患者开发新型诊断工具和治疗策略。

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5-3：PD-L1 and CD8 IHC

内容介绍了为评估来自临床试验GO30140和IMbrave150的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织切片中PD-L1和CD8的水平而进行的免疫组化（IHC）测定。这些检测对于了解肿瘤微环境中的免疫反应非常重要，可帮助了解抗PD-L1抑制剂等免疫疗法的潜在疗效。

PD-L1 IHC 检测：

• PD-L1蛋白水平使用Ventana Medical Systems公司开发的PD-L1 IHC SP263检测法进行评估。
• 该检测方法可**鉴定肿瘤细胞（TC）和肿瘤浸润免疫细胞（IC）上的 PD-L1 表达**。
• TC 评分代表表达 PD-L1 的肿瘤细胞总数的百分比。
• IC 评分的定义是任何强度的 PD-L1 染色免疫细胞所占肿瘤面积的比例。
• TC和IC综合得分有三种不同的评估临界值： IC或TC≥1%、≥5%或≥10%。

CD8 IHC 检测：

• 使用 Ventana Benchmark 系统和 Agilent Dako 公司生产的 C8/clone 144B 抗 CD8a 单克隆抗体进行 CD8 IHC 检测。
• 瘤内 CD8 T 细胞密度通过计算 CD8 染色细胞占肿瘤区域的百分比来确定。

这些**IHC检测的结果有助于确定哪些患者更有可能对免疫疗法产生反应。肿瘤细胞或免疫细胞上高水平的PD-L1表达表明，肿瘤正在利用PD-L1抑制免疫反应，使其成为PD-L1抑制剂的良好靶点。同样，肿瘤内CD8+ T细胞密度高表明免疫反应活跃，有利于免疫疗法**。

使用不同的PD-L1表达截断值可以更细致地了解肿瘤内的免疫状况。通过分析PD-L1和CD8染色的分布和强度，研究人员可以深入了解免疫反应的复杂性，并据此制定治疗策略。这些生物标记物还可用于在临床试验中对患者进行分层，帮助确定针对不同患者的最有效治疗方案。

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5-4：多重 IHC 和数字病理学

这些方法对于了解肿瘤微环境（TME）内复杂的相互作用至关重要，可帮助了解对免疫疗法的潜在反应。

多重 IHC 检测：

• 使用 Ventana BenchMark Ultra 自动染色仪器对 147 例治疗前肿瘤组织进行了两组五重免疫荧光检测。
• 面板 1（肿瘤-瘤体-免疫背景面板）包括针对 HepPar1、Arginase1、CD8、成纤维细胞活化蛋白、CD31 和 MHC I 类的抗体。
• 面板 2（T 细胞功能面板）包括针对 HepPar1/Arginase1、CD3、PD-L1、PD-1 和 GZMB 的抗体。
• 荧光图像采集在蔡司 Axio Scan.Z1 显微镜上进行。

数字病理分析：

• 对扫描图像进行图像分析，以统计感兴趣区（ROI）（如肿瘤、表皮细胞、基质区和坏死区）内具有唯一染色或同时染色标记物的细胞数量。
• ROI 由病理学家手动标注，并由数字病理算法识别。
• 算法用于识别自动计算的 ROI 中的表型、对象密度和空间相互关系。

这些多重 IHC 检测和数字病理分析为 TME 提供了一个全面的视图，使研究人员能够评估各种免疫细胞的存在和活性及其与肿瘤和基质细胞的相互作用。PD-L1、PD-1 和 GZMB 抗体尤其令人感兴趣，因为它们与免疫检查点抑制剂有关，而免疫检查点抑制剂是 HCC 免疫疗法的关键组成部分。

在组织水平上量化和分析这些标记物的能力对于了解免疫反应和预测对免疫疗法的反应至关重要。通过确定与有利的免疫反应或更具侵袭性的肿瘤相关的标记物，这些检测方法有助于临床试验患者的选择和个性化治疗策略的制定。此外，数字病理学方法可以进行更客观的定量分析，减少观察者之间的差异，提高结果的准确性。

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5-5：小鼠体内肿瘤实验

内容介绍了作为肝细胞癌（HCC）研究一部分而进行的体内小鼠肿瘤实验。这些实验涉及使用转基因小鼠模型来研究特定基因构建物和治疗方法对 HCC 发生和发展的影响。

载体设计和使用：

• 使用了三种不同的载体：pT3-EF1a-MYC-lucOS、pT3-N90-CTNNB1 和 CMV-SB13。这些载体分别用于表达 MYC 致癌基因、CTNNB1 致癌基因或转座酶编码基因。
• pT3-EF1a-MYC-lucOS 载体是之前生成的，可从 Addgene 网站获得（质粒编号：129776）。
• pT3-N90-CTNNB1 载体由 X. Chen（加州大学）提供。
• CMV-SB13 质粒由 S. Lowe（纪念斯隆-凯特琳癌症中心）提供。
• 所有载体均经过核苷酸测序和限制性酶消化验证，以确保其完整性。

水动力尾静脉注射：

• 小鼠经侧尾静脉注射含有质粒的无菌 0.9% 氯化钠溶液。
• 注射总量相当于小鼠体重的 10%，注射时间为 5-7 秒。
• pT3-EF1a-MYC-IRES-luciferase-OS （MYC-lucOS）载体与 pT3-N90-CTNNB1 （CTNNB1）载体结合使用，转座子与转座酶编码质粒的比例为 4:1。

小鼠：

• 野生型雌性 C57BL/6 小鼠购自 Envigo 公司，用于处理实验（使用单克隆抗体）或流式细胞仪实验。
• 所有小鼠实验均经西奈山伊坎医学院动物护理和使用委员会批准（协议编号：IACUC-2014-0229）。
• 小鼠在无特定病原体的条件下饲养，并在研究开始前接受检查，以确保其健康和适应实验室环境。
• 实验对象为 6 至 8 周大的小鼠，当肝肿瘤直径达到 1 厘米时终止实验。

荧光素酶检测：

• 使用 IVIS Spectrum 系统（Caliper LifeSciences）进行体内生物发光成像（BLI），以量化肝脏肿瘤负荷。
• 小鼠腹腔注射 D-荧光素（150 毫克/千克），5 分钟后成像。
• 使用 Living Image 软件（http://v.LI 4.7，Caliper LifeSciences）对荧光素酶信号进行量化，并通过减去背景信号进行归一化。
• 荧光素酶信号比平均信号低一个对数值的小鼠被排除在研究之外。

这些体内小鼠肿瘤实验对于研究 HCC 的进展以及测试不同基因构建和治疗对肿瘤生长和发展的影响非常有价值。使用荧光素酶成像技术可以无创监测肿瘤负荷和随时间推移的进展情况，为 HCC 的临床前研究提供了有力的工具。

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5-6：研究设计

内容详细介绍了作为肝细胞癌（HCC）研究一部分的小鼠体内肿瘤实验的实验设计、治疗方案、细胞分离和流式细胞仪分析、免疫组化（IHC）标记以及统计注意事项。

样本量和统计考虑因素：

• 样本量的计算是为了在显著性水平为 0.05 和功率为 0.80 的条件下检测出两倍的组间差异，允许每组最多有一个重复缺失。
• 疗效实验使用了更大的重复组规模，以将折叠变化检测提高到接近 1.5 倍。

治疗：

• 水动力递送质粒 1 或 2 周后开始治疗，此时恶性肿瘤细胞已经存在。
• 在抗体实验中，抗-PD-L1 或 IgG1 每周注射三次，剂量为 10 毫克/千克；抗-VEGF 或 IgG2 每周注射两次，剂量为 5 毫克/千克。

细胞分离和流式细胞术分析：

• 用 PBS-EDTA 灌注肝脏，切碎并酶解以分离免疫细胞。
• 将肝细胞从悬浮液中分离出来，储存在-80°C以备下游实验，并进一步处理以裂解红细胞。
• 用各种抗体对细胞进行染色，以检测不同的免疫细胞群，包括树突状细胞（DC）、单核细胞、巨噬细胞、Kupffer 细胞（KC）、中性粒细胞、CD4+ T 细胞、Tregs 和 CD8+ T 细胞。
• 使用 FlowJo 软件进行数据分析。

免疫组织化学（IHC）标记：

• 使用 Leica Bond RX 自动免疫印迹仪对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织的 4-μm 厚切片进行 HCC 小鼠样本的 IHC 标记。
• 抗原用柠檬酸盐溶液回收，切片用过氧化氢阻断。
• IHC 标记使用了以下抗体：内粘蛋白和 CD8。
• 加入适当的阳性和阴性对照，并计算每平方毫米 CD8+ T 细胞或内黏蛋白+ 血管的数量。

这些实验提供了在小鼠模型中研究 HCC 的综合方法，包括使用特定的基因构建物、治疗方法和各种免疫细胞特征。统计方面的考虑确保了实验具有检测组间显著差异的必要能力。使用流式细胞术和 IHC 可以详细描述免疫反应和肿瘤微环境的特征，从而深入了解肿瘤进展的机制和潜在治疗干预的效果。

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5-7：统计分析

内容概述了研究中使用的统计分析方法，以确定肝细胞癌（HCC）患者对阿特珠单抗和贝伐珠单抗联合疗法的临床反应或耐药性的潜在分子相关性。

临床应答和耐药定义：

• 临床应答的定义：根据实体瘤应答评估标准（RECIST），GO30140 A组队列（单臂研究设计）中的应答者（CR/PR），以及与IMbrave150队列（随机研究设计）中的对照组相比，无进展生存期（PFS）/总生存期（OS）获益更多。
• 临床耐药的定义：与对照组相比缺乏反应或PFS/OS获益较少。

差异基因表达分析：

• 使用 R 软件包 limma 对应答者和非应答者进行基因表达差异分析。
• 显著的差异表达定义为绝对对数折合变化>1，调整后的P<0.05。
• xCell deconvolution 分析用于 GO30140 A 组的基线 RNA-seq 计数数据。

基因特征分析：

• 基因特征得分按给定特征中所有基因表达量 log2(CPM)的算术平均值计算。
• 基因组富集分析（GSEA）使用默认参数的 MultiGSEA 软件包和分子特征数据库（MSigDB）中的 Hallmark 基因组集合进行。

人类统计分析：

• 统计分析使用 R 4.0.2 版本进行。
• Kaplan-Meier 方法用于估计存活率。
• 使用分层考克斯比例危险模型和对数似然检验确定危险比（HR）估计值、95% CI和P值。
• 通过确认事件发生时间与舍恩费尔德残差之间不存在显著相关性，验证了比例假设。
• 通过加入性别、年龄、东部合作肿瘤学组（ECOG）表现状态、疾病病因、是否存在大血管侵犯或肝外播散以及血清AFP水平>400ng/ml等项，对HR进行了多变量调整。
• 通过检查Cox比例危险模型中的交互项（包括治疗、治疗组及其交互项），检验了不同治疗效果的生物标志物。

小鼠的统计分析：

• 对于两组以上的比较，采用方差分析（ANOVA）检验。
• 频率比较采用 χ2 检验。
• 组数根据初步实验确定，没有使用统计方法预先确定样本数。
• 治疗的组别分配是为了确保荧光素酶信号相同，结果评估不是以盲法进行的。
• 存活率差异采用卡普兰-梅耶检验法计算。
• Prism（v.8，GraphPad Software）用于图表创建和统计分析。

所述统计方法既稳健又适合研究设计，包括单臂研究和随机对照试验。使用 limma 进行差异基因表达分析和使用 GSEA 进行基因特征分析，为确定临床反应和耐药性的分子相关性提供了一种全面的方法。对人类和小鼠进行的统计分析具有很好的合理性，应能确定与治疗相关的潜在生物标志物和作用机制。

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