cap流程图_生工技术 | RACE种类、特点及其原理

RACE的种类、特点及其原理

实际实验中有时候只知道mrna的一部分序列而不知其全长序列，造成了一些苦恼，而1988年Frohman报道RACE技术可以解决此问题。

RACE也可以称为cDNA 末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends)，是一种对mRNA进行末端快速扩增的技术，可从样本中快速扩增 cDNA 的 5′端及 3′端的技术。

随着技术不断的发展，从1985年至今，RACE技术经过不断的改进从而有了好几种RACE技术，常见的包括：

经典RACE、Adapter-Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switching RACE、环形RACE、T-RACE等……

这些RACE技术各有特点，下面给大家分别介绍一下：经典RACE

根据克隆RNA的位置，可以分为cDNA 3’末端快速扩增(3’ RACE)和cDNA 5’末端快速扩增(5’ RACE)。3’ RACE

真核生物mRNA的3’末端存在poly A(多聚腺嘌呤核苷酸)，根据此结构对目的mRNA的3’进行扩增的技术原理流程图可见图1。

图1  3’RACE的技术原理流程图5’ RACE

因为mRNA 的3’有特殊结构，而5’没有特殊结构，所以 5’ RACE和3’ RACE有所不同，5’进行扩增的技术原理流程图可见图2。

图2  5’ RACE的技术原理流程图

经典RACE可以扩增RNA，但是对模板结构的要求高，同时因为原核生物的mRNA不具备polyA尾巴结构，没办法用经典的RACE技术进行全长扩增。Adapter-Ligated RACE

在实际获得mRNA时可能会获取到很多已经断裂的mRNA，里面含有很多mRNA的断片段，可能会影响到后续的实验。经过Chenchik等人报道，一种新的改造方式可以进行RACE，为Adapter-Ligated RACE。此种方法先利用T4连接酶将 接头与cDNA两末端连接。在PCR过程中，因为短的cDNA的退火温度低，两端接头容易发生退火，形成像把手一样的结构，抑制了PCR反应，技术原理流程图可见图3。而长片段的cDNA可以进行正常的5’ RACE 和3’ RACE。Adapter-Ligated RACE对模板结构要求不是很高，而且能减少短的cDNA的扩增，但是不一定能扩增到目的基因的全长信息。

图3  Adapter-Ligated RACE的技术原理流程图RLM-RACE

RLM-RACE同样是为了避免RNA断裂产生的副反应。所根据的原理是由于5’端断裂的mRNA没有帽子结构，利用这个特点可先用小牛肠碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase，CIP)将已经断裂的mRNA 5’端暴露的磷酸基团切除，断裂的mRNA 5端为-OH，而全长mRNA不会被切断，全长mRNA加另外的酶将帽子结构去掉，5端为磷酸，接着在连接酶的作用下与接头相连，但上述断裂的mRNA因为预先处理5端已经成为-OH无法相连，基于此可以扩增出目的mRNA的全长。技术原理流程图可见图4。RLM-RACE通过设计可以扩增出完整的全长序列，但处理过程中用的酶较多。

图4  RLM-RACE的技术原理流程图Cap-switching RACE

Cap-switching RACE是另外一个改进发明的RACE技术，在逆转录时，当cDNA延伸到mRNA 5’时，加入MMLV酶，会在cDNA 3’添加上加入若干个胞嘧啶核苷酸。MMLV酶所催化的加尾反应是需要依赖模板，帽子结构也需要存在的，因此只有完整的cDNA才能加上胞嘧啶。根据此种情况引入特异性引物，其引3’ 末端含有 poly G可与cDNA上的poly C退火，在DNA聚合酶的催化下以新添加的引物为模板实现接头转化，从而进行PCR。技术原理流程图可见图5。

Cap-switching RACE根据MMLV酶的性质，可以避免扩增断裂的mRNA。

图 5  Cap-switching RACE的技术原理流程图环形 RACE

环形RACE(cRACE)的发明是为克隆已知部分序列的mRNA设计的。cRACE利用含poly T的引物进行逆转录，经过RNase H降解模板后加入T4 连接酶。加入了T4 连接酶之后会发生两种反应：

环化 — 一条链的首尾相连

串联 — 两条链的头尾相连

以上两种反应的产物，可以用已知序列设计的引物产生第二条链。然后在未知序列的两端设计引物，进行PCR。技术原理流程图可见图6。

此方法必须知道中间的部分序列，若完全不清楚，则需要选用其他方法。

图 6  环形RACE(cRACE)的技术原理流程图T-RACE

T-RACE是另外一种被发明改造的RACE技术。T-RACE先将RNA材料进行处理，使用dUTP代替dTTP作为原料合成第一条链，合成第一条链之后在其两端加上接头(5’ 用Cap-switching RACE接上接头)，再通过接头合成第二条链，加引物进行扩增，扩增时加dNTP(不带dUTP)，进行了不对称PCR加UDG酶进行处理，后续用一对引物进行扩增，得到相应产物。技术原理流程图可见图7。

图 7  T-RACE的技术原理流程图

以上介绍的为RACE的种类、特点及其大致原理，下面会给大家介绍RACE的应用及其相关的文献。参考文献

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