vscode能编辑jsp吗_【前沿技术】能定点编辑m6A的方法，你知道吗？

大家好，我是喜欢看CRISPR花式变戏法的无花果。前段时间为大家介绍了dCas9技术和CRISPR/Cas9文库筛选，发现大家都比较感兴趣，于是我决定一不做二不休，干脆整一个CRISPR系列，具体讲一讲CRISPR衍生出的各种玩法。今天要介绍的是最近发表在 Nature Biotechnology上的一项技术， 利用CRISPR系统定向地将m6A加到某个mRNA的特定碱基上，实现m6A的定点编辑。有了这项技术，以后就可以研究 单个碱基位点 m6A的功能啦！是不是很神奇？赶紧来看一看吧~

  Q&A Q：为什么要发明这项技术？ A：以往我们研究m6A时，往往是进行 整体水平的m6A检测，或者通过MeRIP检测某个RNA片段上是否有m6A位点，之后再通过敲减/过表达m6A相关蛋白研究m6A。然而，如果想要研究 单个位点的m6A功能，就不好实现。 Q：这项技术的原理？ A：m6A甲基化的调控分为三个部分：甲基的写入( Writer)、擦除( Eraser)和读取( Reader)。相信熟悉m6A的小伙伴都知道，这三个过程分别对应三种蛋白，比较常见的Writer蛋白有 METTL3/METTL14复合体，Eraser蛋白有 ALKBH5、FTO，Reader蛋白有 YTHDF1-3等。本文就是利用m6A writer METTL3/METTL14复合体的 m6A写入功能，以及CRISPR系统的 引导编辑功能，实现对RNA单个碱基位点的m6A编辑。  Q：文中使用的CRISPR系统和传统的CRISPR/Cas9有什么区别？ A：文中所使用的dCas13蛋白即 没有切割活性的Cas13(和之前介绍过的dCas9很类似，具体请戳【前沿技术】CRISPR/dCas9技术带你玩转分子互作)，与dCas9不同的是，dCas13靶向的是单链的RNA，而非双链的DNA。 Q：这项技术的优点？ A：如前所述，使用CRSPR/dCas13融合METTL3/14表达的系统能够定点对RNA进行m6A编辑，实现了m6A的单位点研究，并且文中提到该系统脱靶率低，特异性高，这在其他技术手段上是难以实现的。 Q：这项技术容易做吗？ A：这项技术所需要的实验条件要求不高，难点其实是在 sgRNA和dCas13-METTL3/14系统 的设计，操作是常规的载体构建和转染细胞，以及m6A位点的检测和验证，从技术上来说是容易上手的，无论是经验丰富的实验能者还是科研小白都可以尝试。 Q：会不会出现CRISPR系统脱靶问题？ A：脱靶是CRISPR面临的最大问题。本文中作者对该系统的脱靶率进行了检测，证实该系统脱靶率低。当然，在不同细胞中的敲除效率和脱靶率可能都会不同，那就可以像作者一样进行 脱靶率的检测，确保系统的 有效性和 特异性。  接下来，让我们来看看作者具体是如何实现的。 Step1：设计并构建CRISPR/Cas13载体。虽然说构建载体是日常实验中几乎每天都要做的，但是这一最简单的实验却可能是决定后续实验成功与否的关键。本文中的Cas13需要融合表达m6A甲基转移酶，还要去除切割活性( dCas13)，保证高效性和特异性，更需要谨慎设计。作者对这一系统的构建经过了以下过程： ①选择合适的甲基转移酶。为了保证系统的特异性，首先要保证Cas融合蛋白结合RNA位点的特异性。因此需要无结合RNA活性却具有催化活性(能转移甲基)的甲基转移酶。作者选择了METTL3，并对其结合及催化活性进行了检测。 ②设计RNA靶向融合蛋白系统。首先将METTL3的锌指RNA结合结构域去除(METTL3ΔZF)进一步削弱其RNA结合能力；又将这一改造的蛋白与METTL14与METTL3互作的结构域融合表达作为候选；最后通过连接序列将dCas13和这两种改造的蛋白融合表达( dCas13-M3，dCas13-M3M14)。 Step 2：使用大肠杆菌进行验证。首先设计dCas13载体中的IPTG诱导型启动子和组成型表达的gRNA，构建包含特定序列的(GGACU)的靶基因转录载体(人工合成以方便检测)。然后将两种构建好的质粒转化大肠杆菌，使用 MeRIP-RT-qPCR和 MeRIP-seq检测IPTG诱导前后的mRNA甲基化情况。dCas13-M3和dCas13-M3M14均能有效对RNA进行m6A编辑。测序结果显示两者的脱靶效率均在可控范围内，且与其甲基化活性相关。

  Step 3：在人源细胞中验证系统对外源转录本的m6A编辑作用。作者设计了一段人工合成的目标转录本syn，将其连接在 报告基因Cluc的3‘-UTR端，并且设计了相对应的gRNA，共转染HEK293T细胞。Me-RIP-RT-qPCR检测Cluc syn的m6A水平以说明系统的靶向编辑效率。进一步将合成基因换成Socs2基因的转录本，获得了相同的结果，表明Cas13-M3、Cas13-M3M14能够有效对外源转入的RNA进行靶向位点的m6A编辑。 

  Step 4：设计构建定位于胞质/核的编辑系统。在dCas13-M3/dCas13-M3M14中插入胞质或核表达的 定位序列以及 标签 蛋白，用免疫荧光的方法验证定位(见下图)。 

  Step 5：在人源细胞中验证系统对内源转录本的m6A编辑作用。设计靶向 Actb A1216和 Gapdh A690位点的gRNA，与dCas13-M3nes/nls、dCas13-M3M14nes/nls共转染HEK293T细胞，Me-RIP-RT-qPCR结果显示这两个转录本的位点可以被加上m6A甲基。 

 为了进一步检验该系统是否适用于具有生物学意义的基因编辑，作者又选择了两个有代表性的基因 Foxm1(胶质瘤中高甲基化)和 Sox2(甲基化调控干细胞分化)作为靶向转录本。获得的结果与Actb和Gapdh的结果类似。

  Step 6：靶向RNA甲基化系统的特异性检测。为了检测dCas13-M3/M3M14系统甲基化编辑的 特异性，将gRNA设计为靶向A690上游8个碱基。m6A IP显示被编辑的位点在A690处富集，说明该系统在内源转录编辑上有较好的特异性。

  Step 7：脱靶率检测。用Me-RIP-seq检测内源转录本m6A编辑的脱靶率，发现dCas13-M3M14与对照相比差异基因数量要远高于dCas13-M3，表明dCas13-M3脱靶率更低。

   Step 8：验证dCas13编辑系统产生的m6A对靶基因RNA的影响。m6A的修饰往往会影响靶基因的表达量，从而产生生物学意义。为了验证该系统产生的m6A修饰对 靶基因表达量的影响，对靶向Actb A2316位点编辑的细胞进行 RNA-seq。以往研究发现该位点的m6A促进Actb mRNA的降解。转入dCas13-M3/dCas13-M3M14的细胞Actb表达量显著降低。

作者又将该系统靶向具有m6A相关 可变剪接位点的 Brd8和 Znf638，结果两个基因RNA的可变剪接均显著升高。

  总结其实之前已有报道使用CRISPR/Cas9系统对RNA进行m6A编辑(相关文章发表于nature chemical biology, 全文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-019-0327-1)，相比较而言，本文使用的dCas13系统操作 更简单， 脱靶率更低，且 使用范围更广(可根据需要选择定位于 核还是 胞质)。相信在不久的将来，除了实现RNA的m6A定点植入外，还能实现m6A的定点擦除，甚至可以实现m6A的定点读取。届时，我们就能真正对m6A展开单个位点的研究。 正在做m6A课题研究的你，不妨试试这一新技术吧。 注：此推文未经许可禁止转载！ 阅读推荐：

• 【前沿技术】CRISPR/dCas9技术带你玩转分子互作

• 【前沿技术】高水平研究经常用到的基因筛选方法，你Get了吗？

• ELISA技术：从技术细节到数据分析演示

• 用好这个技术，顶刊离我们又近了一步！

• 【课题套路】一文解读m6A去甲基化酶研究的课题设计思路

如果您或者科室有科研上的困扰 扫码备注：科研思路探讨