提高显微镜分辨率方法_快速、高效提高所有样本分辨率的方法Lighting

Leica Lighting 通用性多色超高分辨率图像的自适应算法

今天为大家介绍一种可以快速、高效提高所有样本分辨率的方法-Leica Lighting。

一、显微镜技术参数

还记的公众号《ZeissLSM880和Leica TCS SP8 STED 参数设置导引》中提到考量显微镜常用的技术参数吗？(图1)，我们再一起来加深一下印象，空间分辨率、成像速度、成像视野大小、光毒性和成像深度等这些参数在一定范围内相辅相成，超过一定范围又会相互制约。

但是如果我的样品荧光比较弱，样品自身运动速度相对比较快，而我同时又需要较高的分辨率，需要拍摄较长的时间，我该怎么办呢？别担心，随着技术的发展，总有办法解决您的问题，比如Leica Lighting通用性超高分辨自适应图像。

图1. 考量显微镜常用的技术参数

二、Leica Lighting原理及特点

Leica Lighting自适应算法就是一种可以快速、高效提高所有样本分辨率的方法，使用方便、一键实现。与对整张图像应用一组参数的传统Deconvolution技术不同，Lighting针对每个体素计算出一组合适的参数，从而以最高的保真度揭示每一个细节,分辨率可达120nm(图2)。并且Lighting适用于所有样本、所有实验，它可以最大限度从拍摄的样品中提取信息，自动解析原本不可见的最细微结构和细节，对于弱荧光信号样本效果显著。同时，Lighting利用GPU上高度并行化的系统优化计算，可使图像解析速度达到闪电级别瞬间完成，在实现高分辨率的同时又能保证时间分辨率。Lighting技术常搭载在共聚焦显微镜系统上，其成像视野大小、成像深度和光毒性与共聚焦系统并无二异，大幅提高了该技术的应用。除此之外，Lighting除了可以处理共聚焦显微镜图像，还可以处理双光子、STED文件，无论从分辨率上还是从图像信噪比上均有很大提升。

图2. Lighting原理及自适应过程

三、Leica Lighting图像采集及优化

通过缩小针孔(pinhole)来增加分辨率这个想法在很多地方都有描述，包括Jim Pawley的“The Handbook ofConfocal Microscopy”，但是该技术在过去几十年中均未得到具体应用，主要在于缩小针孔后到达检测器的光子数成倍降低，超过了普通检测器的最小检测范围，从而造成其荧光信号无法被检测到。随着技术的发展，越来越多的高灵敏度检测器被生产和使用，这种通过缩小针孔来提高分辨率的方法再次进入大家的视野并逐渐被商品化，从而得到大规模应用。

Lighting技术就是利用了该原理来提高图像的分辨率至120nm，其检测器使用Leica高灵敏度HyD检测器，具有大动态范围、高灵敏度和高信噪比等特点，使得Lighting技术在实现过程中可以获得较多的图像信号，在后期自适应处理过程中更能保证图像的真实性。

图像采集过程中可优化的几个方面：

(1)Pinhole：在荧光信号强度允许的情况下将pinhole缩小到0.6AU，可以有效提高图像的分辨率；

(2)Detector：尽量使用HyD检测器，以提高荧光信号的收集效率；

(3)Pixel Size：为保证采样频率，通过调节Format(图像采集分辨率)和Zoom(视野放大倍数)，使得pixel size尽量小于采集图像所用物镜分辨率的一半(Abbe Resolution = λ/2NA)；

(4)Average：为提高图像质量，可适当使用Line Average和Frame Average，如果样品有轻微移动，不建议采用Frame Average。

四、Leica Lighting数据处理

1. 选择需要处理的图像文件，在ProcessTools下调用Lighting process后期数据处理程序，设置其相关处理参数。

(1)Type：图像类型，可以是confocal、STED、Multi-photone，系统自动识别，一般无需更改；

(2)Number of iterations：迭代处理的循环次数。次数越多，效果越明显，但有可能会人为增加artifacts。Auto可以自定义处理的循环次数。

(3)Contrast Enhancement：在反卷积之前提高对比度的程度，可在0-1之间选择，数值越大，对比度越高。Auto可以自定义对比度程度。

(4)Cut-off：去除背景的程度，阈值以下像素点的荧光强度为零。该数值为百分比，可在0-1之间调节。Auto可以自定义去除背景的程度。

(5)Regularization method：计算过程中消除噪音影响的两种方法，Total Variation和Good’s Roughness，可以使图像更平滑。

(6)Regularization parameter：数值越高，去除噪音的程度越高。

(7)Optimization：对图像信噪比的优化，可以使图像更平滑，有五个选项可以选择(None, Low, Medium, High, Very High)，如果图像的噪音较高，应选择High模式。

(8)Post Filter：在Optimization之后进行的滤镜处理，可以使图像更平滑，有两种方法可以选择Bilateral(边界法)和GaussianFilter(高斯法)。

(9)Normalization：如何均一化信号值，有两种方式 Range(16bit范围内缩放)和Photo Count光子计数(根据检测的光子数缩放)。

2. 部分参数可由系统默认读取，一般可不做修改，如Excitation Wavelength、Emission Wavelength、Pinhole、Objective、Cover Slip和Mounting Medium信息。

3. STED数据参数设置。如果是STED的数据，则需要确认STED数据采集参数，包括DepletionWavelength、Depletion Power、Saturation Factor、Excitation LaserMode、Depletion Laser Mode、Axial Percentage、Drift Correction和Gated相关参数，该数据一般由系统默认读取，确认其是否正确。

(1)Saturation Factor：反映有多少荧光信号被压制激光压制；

(2)Axial Percentage：3D Z轴STED所占的比例，0代表只有XY STED，1代表只有Z轴STED。

(3)Gated：如果应用门控技术，需要确定门控的起始时间点和终止时间点，只有处于该时间点范内的光子才可以到达检测器从而被接收。

4. 一键Apply，快速实用，欢迎大家到人环楼305A(共享仪器平台)试用！！！

附：共享仪器平台光学仪器配置及设备特点

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