提高显微镜分辨率方法_1.6 提高光学显微镜对比度方法

在光学显微镜中，对比度用来区分微生物和周围环境。细胞染色可以提高对比度，继而在亮视野下观察细菌。除了染色，其他的方法包括相位对比、微分干涉对比、暗场和荧光染色。 染色：增强亮场中的对比度 细胞被染色可使它们在亮场显微镜下更易被观察，每一类染料都对特定的细胞有亲和力。微生物学中使用的很多染料都是带正电的，被称为碱性染料，例如亚甲基蓝、结晶紫和番红。碱性染料能与带负电荷的细胞成分(核酸和酸性多糖)紧密结合，也能与细胞表面结合，因为细胞表面带负电荷。因此，可以非特异性地染色大多数细菌细胞。 简单的染色过程包括：在一个干净的载玻片上干燥细胞悬浮液，用碱性染料稀释溶液浸泡1~2分钟，在水中冲洗几次，然后吸干，用油镜观察。 常规细菌染色与观察过程 鉴别染色：革兰氏染色 使不同种类细胞呈现不同颜色称鉴别染色，微生物学中一种重要的鉴别染色是革兰氏染色。根据它们在革兰氏染色中的反应，细菌可以分为两种：革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈粉红色，颜色差异是细菌的细胞壁结构不同造成的。关于革兰氏染色技术的历史由来及其机制，请参考：革兰氏染色技术——由来；革兰氏染色技术——染色机制 相差和暗场显微镜 尽管染色在光学显微镜中广泛使用，但需要杀死细胞。有两种光学显微镜可以改善未染色细胞(也就是活细胞)的图像对比度：相差显微镜和暗场显微镜，特别是相差显微镜，在教学和科研中广泛使用。 相差显微镜的依据：细胞与周围环境的折射率不同(即材料改变光速)，因此，通过细胞的光与通过周围液体的光相位不同，这种细微的差别被相差物镜放大，结果在明亮的背景上形成一幅深色的图像。 暗场显微镜下，光线不能穿透标本，光线是从标本的侧面直接照射过来，只有照射到标本时散射的光线才能到达透镜。因此，标本在黑暗的背景上显得明亮。暗场显微镜比光学显微镜分辨率更高，有些物体可以用暗场显微镜来分辨，而亮场甚至相差显微镜都无法分辨。暗场显微镜也是观察微生物运动的一种好方法。 明场、相差和暗场观察 荧光显微镜 荧光显微镜能观察发出荧光的标本。在荧光显微中，细胞从上面用一种颜色的光照射，从而产生荧光，经滤光片只看到荧光，因此细胞可在黑色的背景发光。 细胞发出荧光，要么是因为它们含有天然的荧光物质，如叶绿素，要么是因为它们被荧光染料染色。DAPI(46-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)是一种广泛使用的荧光染料，可将细胞染成明亮的蓝色，因为它与细胞DNA形成复合物。DAPI可用于观察自然栖息地(如土壤、水、食物或临床标本)中的细胞。DAPI染色和荧光显微镜广泛应用于临床诊断和微生物生态学中，以实现自然环境或细胞悬浮液中细菌的计数。 上述显微大法都是在二维层面观察微生物细胞，想看细胞的三维图像怎么办呢？ 点关注不迷路，且听明天再继续。

参考资料：

Brock Biology of Microorganisms, 15^th Edition

Chapter 1: The Microbial World Part

1.6: Improving Contrast in Light Microscopy

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