在光学显微镜中,对比度用来区分微生物和周围环境。细胞染色可以提高对比度,继而在亮视野下观察细菌。除了染色,其他的方法包括相位对比、微分干涉对比、暗场和荧光染色。
染色:增强亮场中的对比度
细胞被染色可使它们在亮场显微镜下更易被观察,每一类染料都对特定的细胞有亲和力。微生物学中使用的很多染料都是带正电的,被称为碱性染料,例如亚甲基蓝、结晶紫和番红。碱性染料能与带负电荷的细胞成分(核酸和酸性多糖)紧密结合,也能与细胞表面结合,因为细胞表面带负电荷。因此,可以非特异性地染色大多数细菌细胞。
简单的染色过程包括:在一个干净的载玻片上干燥细胞悬浮液,用碱性染料稀释溶液浸泡1~2分钟,在水中冲洗几次,然后吸干,用油镜观察。
常规细菌染色与观察过程
鉴别染色:革兰氏染色
使不同种类细胞呈现不同颜色称鉴别染色,微生物学中一种重要的鉴别染色是革兰氏染色。根据它们在革兰氏染色中的反应,细菌可以分为两种:革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈粉红色,颜色差异是细菌的细胞壁结构不同造成的。关于革兰氏染色技术的历史由来及其机制,请参考:革兰氏染色技术——由来;革兰氏染色技术——染色机制
相差和暗场显微镜
尽管染色在光学显微镜中广泛使用,但需要杀死细胞。有两种光学显微镜可以改善未染色细胞(也就是活细胞)的图像对比度:相差显微镜和暗场显微镜,特别是相差显微镜,在教学和科研中广泛使用。
相差显微镜的依据:细胞与周围环境的折射率不同(即材料改变光速),因此,通过细胞的光与通过周围液体的光相位不同,这种细微的差别被相差物镜放大,结果在明亮的背景上形成一幅深色的图像。
暗场显微镜下,光线不能穿透标本,光线是从标本的侧面直接照射过来,只有照射到标本时散射的光线才能到达透镜。因此,标本在黑暗的背景上显得明亮。暗场显微镜比光学显微镜分辨率更高,有些物体可以用暗场显微镜来分辨,而亮场甚至相差显微镜都无法分辨。暗场显微镜也是观察微生物运动的一种好方法。
明场、相差和暗场观察
荧光显微镜
荧光显微镜能观察发出荧光的标本。在荧光显微中,细胞从上面用一种颜色的光照射,从而产生荧光,经滤光片只看到荧光,因此细胞可在黑色的背景发光。
细胞发出荧光,要么是因为它们含有天然的荧光物质,如叶绿素,要么是因为它们被荧光染料染色。DAPI(46-diamidino-2-phenylindole,4',6-二脒基-2-苯基吲哚)是一种广泛使用的荧光染料,可将细胞染成明亮的蓝色,因为它与细胞DNA形成复合物。DAPI可用于观察自然栖息地(如土壤、水、食物或临床标本)中的细胞。DAPI染色和荧光显微镜广泛应用于临床诊断和微生物生态学中,以实现自然环境或细胞悬浮液中细菌的计数。
上述显微大法都是在二维层面观察微生物细胞,想看细胞的三维图像怎么办呢?
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参考资料:
Brock Biology of Microorganisms, 15th Edition
Chapter 1: The Microbial World Part
1.6: Improving Contrast in Light Microscopy
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