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ELISA
操作流程
(一)
、基本操作流程
方法一
双抗体夹心法(用于检测未知抗原的)
1.
包被:用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为
0.5
~
20
μ
g
/
ml
,按
100ul/
孔加入
酶标板,
4
℃包被过夜。
2.
洗板:
次日弃去孔内液体,
在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体,
加入洗涤液
(约
280-300ul/
孔)
,漂洗
2-3
次,每次
3-5min
;
3.
封闭:按
200-250ul/
孔加入封闭液,室温
2-3
小时或
37
℃
1-2
小时,也可
4
℃封闭
过夜,然后弃去孔内封闭液;
4.
样品处理:用洗涤液或样品稀释液将待检样品
(
含未知抗原
)
稀释至所需浓度;
5.
标准液:用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度(定性分析可省略本
步骤)
;
6.
加样:按排列顺序依次加入
50-100ul/
孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、
阴性对照及阳性对照,室温或
37
℃孵育
30-60min
;
7.
洗板:同步骤
2
;
8.
加酶标抗体:酶标抗体的稀释按产品说明书,按
50-100ul/
孔加入新鲜配制的酶
标抗体,室温或
37
℃孵育
1
小时;
9.
洗板:同步骤
2
;
10.
加底物液显色:
按
100-150ul/
孔加入新配制的
TMB
底物溶液,
室温避光反应
15
~
30
分钟。
11.
终止反应:于各反应孔中加入
50ul
的终止液。
12.
结果判定:可于白色背景上,直接用裸眼观察结果,反应孔内颜色越深,阳性
程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“
+
”
、
“
-
”号表示。也可在酶
标仪上于
450nm(
若以
ABTS
显色,则
410nm)
处测
OD
值。检测时以空白对照孔调零后测
各孔
OD
值,若样品孔中的
OD
值大于阴性对照孔的
2.1
倍,即为阳性。