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七、DNA与蛋白质序列同源分析(进化树构建)

七、DNA与蛋白质序列同源分析(进化树构建) internet网络。如，NCBI的BLAST; ExPASy的Alignment. 软件。如，Vecotr NTI Vector NTI Suit AlignX 同源比较—主窗口 Vector NTI Suit 同源比较—进化树 八、蛋白质一级结构分析 internet网络。 如，ExPASy的primary structure analysis topology prediction. 软件。如，Vecotr NTI, Antheprot Omiga 2.0 ORF Map 三、限制性酶切位点分析 一种能识别特殊，短核苷酸序列，并在DNA的某些位点上切割的蛋白质。细菌包含了400种这样的酶，能识别和切割100种以上不同的DNA序列。 如：EcoRI 识别序列 三、限制性酶切位点分析 找到待分析的核酸序列。 利用Vector NTI软件分析。 利用webcutter 2.0在线分析。(/cutter) 四、DNA模拟电泳 找到待分析的核酸序列。 利用Vector NTI或其他软件分析。 Vector NTI Suit 5.5 模拟电泳 Gene Construction Kit 2.0 模拟电泳 五、PCR 引物设计(杂交探针设计) 引物设计的原则 引物要跟模板紧密结合； 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在； 引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。 引物设计需要考虑的因素 如： 引物长度(primer length)， 产物长度(product length)， 序列Tm值 (melting temperature)， ΔG值(internal stability)， 引物二聚体及发夹结构(duplex formation and hairpin)， 错误引发位点(false priming site)， 引物及产物GC含量(composition)，有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。 引物设计要点 一般引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp，过长或过短都不合适。 引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。 引物设计要点 ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标。 一般情况下，在Oligo 5.0软件的ΔG值窗口中，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间部分ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9(ΔG值为负值，这里取绝对值)，如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。 其原理，引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合，因此5’端与中间段的ΔG值应较高，而3’端ΔG值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。 引物设计要点 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带，且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。 * 个体与数据库比较。 两个或两个以上个体比较。 不同情况： 分析方法： 氨基酸组成。 PI MW 亚细胞定位 包括： 分析方法： 定义： GAATTC GTTAAC 分析步骤： 分析步骤： DNA模拟电泳具有一定实验预示功能。 模拟电泳不能作为实验结果或依据。 注 意： *