ireport中堆叠图去除刻度虚线_流动相中盐浓度对Protein A，Protein L和KappaSelect层析中抗体保留的影响...

Point： Protein A，Protein L和KappaSelect亲和树脂已被广泛用于抗体纯化。通常通过酸性pH来洗脱与这些树脂结合的抗体。此外，可以通过调节流动相中的盐浓度来适当调节洗脱液，因为疏水性相互作用在结合中起主要作用。在这项研究中，我们评估了这三种亲和色谱中流动相中盐浓度对抗体保留的影响。 数据表明，盐浓度对两个亲和结合轻链的色谱柱(即Protein L和KappaSelect)的保留影响要大于Protein A色谱柱。 特别是，降低Protein L和KappaSelect色谱柱流动相中的盐浓度可使洗脱在 较高的pH值 下变得可行。另外，该发现表明，通过降低洗涤缓冲液中的盐浓度，还可在提高pH的情况下在旨在去除弱结合副产物的这两种类型的柱中进行洗涤。对于目标抗体对严格条件敏感的情况，在较高的pH下进行可行的提纯洗涤和洗脱具有实用价值。

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Protein A主要结合Fc区，Protein L和KappaSelect分别结合κ轻链(LC)的可变区和恒定区。最近，几项研究表明，Protein L色谱法是纯化bsAb的有用工具。但是，Protein L色谱柱通常需要的pH值低于通常用于Protein A色谱柱洗脱的pH值，当用于纯化不能承受严格pH值的抗体时，这可能会导致洗脱液中大量聚集体。本研究使用的是WuXiBody格式的bsAb(图1B)是一种低pH敏感分子，通过Protein L色谱纯化时，洗脱液比通过Protein L纯化时相应洗脱液中的聚集体多约20％色谱法。以前，通过在洗脱前添加高pH洗涤液(可稳定bsAb)可以缓解聚集问题。在当前的研究中，我们通过降低洗涤缓冲液的电导率，略微提高了洗涤步骤的pH值，以去除缺少LC的副产物。当这种新方法与以前的策略结合使用时，洗脱液中的总含量会进一步降低。

图1.本研究中使用的三种抗体的示意图。(A)常规单特异性抗体。(B)WuXiBody格式的不对称双特异性抗体(bsAb)。(C)Fab x单链可变片段(scFv)格式的不对称bsAb。在WuXiBody中，通过用T细胞受体(TCR)恒定域替换CH1/CL区，可以促进所需的重链(HC)-LC配对。对于B和C，通过旋钮入孔技术促进了重链异二聚。B和C具有一个LC恒定区，因此具有一个KappaSelect结合位点。

Materials: MabSelect SuRe LX 3ml；保留时间 5min；上样载量：30or2 mg/mL resin。

Capto L 3ml；保留时间 5min；上样载量：2or10 mg/mL resin。

KappaSelect 3ml；保留时间 5min；上样载量：2 mg/mL resin。

Methods:

4.结果与讨论

4.1.梯度缓冲液中盐浓度对Protein A色谱中抗体保留的影响

mAb(图1A)用于该部分研究。当以该Protein A树脂的典型密度(即30mg/mL resin)加载色谱柱时，盐浓度的差异对保留的影响相对较小(图2A)。在梯度缓冲液中，在盐浓度降低的情况下，pH值略有升高，洗脱的结合抗体。然而，当以显着降低的密度(即2mg/mL resin)加载色谱柱时，盐对保留的影响变得更加明显(图2B)。在盐浓度降低的情况下，在明显提高的pH下洗脱抗体。具体而言，当梯度缓冲液分别包含50 mM，20 mM和10 mM盐时，洗脱峰开始时的pH分别为3.70、3.75和3.85。 数据表明，降低流动相中的盐浓度会削弱抗体结合，因此可以在不太严格的条件下洗脱。

图2.使用具有不同电导率的梯度缓冲液获得的Protein A色谱图的叠加图。(A)以正常密度(即30mg/mL resin)加载柱子。(B)以显着降低的密度(即2mg/mL resin)加载柱。在每种装载密度下进行了3次试验，对于1-3次试验，梯度缓冲液分别包含50mM，20mM和10mM盐。红色实线表示pH；黑色，棕色和蓝色实线表示吸光度，相同颜色的虚线表示相应的电导率。

4.2.梯度缓冲液中盐浓度对Protein L色谱中抗体保留的影响

用这三种抗体进行的色谱图分别显示在图3A，B和C中。 对于所有三种抗体，观察到相同的趋势： 在降低的盐浓度下，与色谱柱结合的抗体在增加的pH下洗脱。 在每种情况下，对于梯度缓冲液中盐含量不同的运行(其他条件对于所有三个运行而言都是相同的)，均需标记洗脱开始时的pH值(图3)。 根据数据，与 Protein  A色谱相比，盐浓度在 Protein   L色谱中对抗体 保留的影响更大。 例如，对于使用mAb进行的运行，当梯度缓冲液中的盐浓度从50 mM降低至10 mM时， Protein   A和 Protein   L洗脱开始时的pH从3.7变为3.85和3.6到4.0分别进行色谱分析(有关详细信息，请分别参见图2B和3A)。 除mAb外，两种bsAb还用作其梯度缓冲液中含有不同量盐的上样材料。 从以前的研究中得知，WuXiBody格式的bsAb(图1B)对严格条件敏感，并且在暴露于低pH值时会形成大量聚集体。因此，当以较高的盐浓度(即50 mM)洗脱时需要较低的pH值时，洗脱峰会分裂(图3B，黑线)。 根据SEC-HPLC数据，峰的早期和晚期部分分别包含大约16％和35％的聚集体(未显示SEC色谱图)。对于Fab x scFv格式的bsAb(图1C)， 还包含一定量的Fab x Fab同二聚体副产物，洗脱时间比Fab x scFv异二聚体更早，导致色谱图中有一个较小的早期洗脱峰(图3C)。 值得注意的是，从图3C中可以看出，Fab x Fab同二聚体和Fab x scFv异二聚体之间的分辨率随着盐浓度的增加而提高，这与以前的报道一致。

图3.使用具有不同电导率的梯度缓冲液获得的Protein L色谱图的叠加图。(A–C)加载样品分别是mAb，WuXiBody格式的bsAb和Fab x scFv格式的bsAb。对于每种抗体，进行了三轮操作，对于第1-3轮，梯度缓冲液分别包含50mM，20mM和10mM盐。红色实线表示pH；黑色，棕色和蓝色实线表示吸光度，相同颜色的虚线表示相应的电导率。在每种情况下，在不同的条件下，标记洗脱开始时的pH。

4.3.梯度缓冲液中盐浓度对KappaSelect色谱中抗体保留的影响

对于所有运行，色谱柱均以2mg/mL resin上样。用这三种抗体进行的色谱图分别显示在图4A，B和C中。同样，对于所有三种抗体都观察到了相同的趋势：在降低的盐浓度下，与色谱柱结合的抗体在增加的pH下洗脱。在每种情况下，对于梯度缓冲液中盐含量不同的运行(否则，所有三个运行的条件都相同)，则标记洗脱开始时的pH值(图4)。根据数据，盐浓度对KappaSelect色谱法中的抗体保留也有相对较大的影响，这与Protein L色谱法中的相当。 对于包含两个LC恒定区(因此有两个KappaSelect结合位点)的mAb，洗脱峰的尾部显着，尤其是在高盐浓度(即50 mM)下(图4A)，这表明该抗体在高盐浓度下具有很强的结合力。在这种情况下，需要较低的pH值进行洗脱。对于包含一个LC恒定区(因此有一个KappaSelect结合位点)的两种bsAb，尽管在高盐浓度下(即50 mM)明显出现尾峰，但洗脱在所有三种盐浓度下都相对完成(图4B和C)。值得注意的是，在这种情况下，包含两个LC恒定区并因此包含两个KappaSelect结合位点的Fab x Fab同二聚体副产物与产物的结合更紧密，并且主要存在于峰尾和柱带中(数据未显示)。

图4.使用具有不同电导率的梯度缓冲液获得的KappaSelect色谱图的叠加图。(A–C)加载样品分别是单特异性抗体，WuXiBody格式的bsAb和Fab x scFv格式的bsAb。对于每种抗体，进行了三轮操作，对于第1-3轮，梯度缓冲液分别包含50 mM，20 mM和10 mM盐。红色实线表示pH；黑色，棕色和蓝色实线表示吸光度，相同颜色的虚线表示相应的电导率。在每种情况下，在不同的条件下，标记洗脱开始时的pH。

4.4.新发现在Capto L中用于低pH敏感性bsAb的应用

从先前和当前的研究中获悉，正在研究的WuXiBody形式的bsAb对低pH敏感，并且在从Capto L柱洗脱时显示出形成聚集体的高趋势。Capto L洗脱液中的总含量比相应的Protein A洗脱液中的总含量高约20％。在先前的研究中，通过在洗脱前添加高pH值的洗液(使bsAb稳定)可最大程度地减少聚集。这种方法将Capto L洗脱液中的总含量降低到大约13.5％，仍然比Protein A洗脱液的相应值高约3％。在当前的研究中，除先前采用的策略外，我们还略微提高了另一个洗涤步骤的pH(该洗涤缓冲液的电导率相应降低)，目的是去除弱结合的LC缺失副产物。降低电导率使得在升高的pH值下进行洗涤成为可能，因为这项工作的发现表明，降低电导率会削弱副产物的结合力，从而使洗涤步骤可以在更高的pH值下进行，并且仍然可以达到同样有效的副产物清除率。该洗涤步骤是新旧方案之间的唯一区别(前者和后者方法分别使用20 mM柠檬酸盐，pH 3.8和10 mM柠檬酸盐，pH 3.9)。图5显示了按照旧的和新优化的程序进行的Capto L色谱图的叠加图。 在新条件下对Capto L洗脱液进行SEC-HPLC分析表明，这种优化可将总含量进一步降低3％，使其大约与相应的Protein A洗脱液中的含量相同 (精确地，经过优化，Capto L洗脱液中的总含量降至11.7％，而Protein A洗脱液的相应值为11.1％)。

图5.按照旧的和新近优化的程序进行的Capto L色谱图的叠加图。对于新方法，在略微增加的pH值下执行了旨在去除弱结合的缺少LC的副产物的洗涤步骤(新方法和旧方法分别为3.9和3.8)。浅蓝色和深蓝色线条，分别在新旧协议下的吸光度。浅橙色和深橙色线条，分别在新旧协议下的pH值。

结论 在这项研究中，我们评估了流动相中盐浓度对Protein A，Protein L和KappaSelect亲和色谱中抗体保留的影响。数据表明，盐浓度对两个LC结合亲和力色谱柱中保留的影响比对Protein A色谱柱更大。特别是，对于Protein L和KappaSelect色谱，将梯度缓冲液中的盐浓度从50 mM降低到10 mM，可使洗脱pH值增加约0.5个单位(即从2.9到3.4)。因此，通过降低流动相中的盐浓度，可以在较温和的条件下实现洗脱。此信息对于对恶劣条件敏感的抗体特别有用。正如低pH敏感性抗体所证明的那样，通过稍微降低pH值(可通过降低洗涤缓冲液中的电导率实现)的副产物清除洗涤，再结合洗脱前的高pH值洗涤，可以大大降低低pH值触发的聚集。总之，当前研究提供的信息可为使用Protein L或KappaSelect亲和层析纯化低pH敏感性抗体的洗脱增加聚集提供一种解决方案。

参考文献：https://doi.org/10.1016/j.pep.2020.105786