睡眠时的局部目标记忆再激活

摘要
通过目标记忆再激活（targeted memory reaction，TMR）实现记忆巩固，TMR在睡眠期间重现训练线索或是内容。但是不清楚TMR对睡眠皮层振荡的作用是局部的还是整体的。本文利用嗅觉的独特功能神经解剖学及其同侧刺激处理，在一个脑半球进行局部TMR。在最初就有气味刺激条件下，受试者学习单词与出现在左右视野中的位置间的联系。本文发现在任务训练期间，侧向的时间相关电位表示单半球的记忆过程。在学习后的小睡中，在非快速眼动（non-rapid eye movement，NREM）睡眠中进行气味刺激。在睡眠期间进行局部TMR后，cued半球（与受刺激鼻孔同侧）处理特定单词的记忆得到改善。单侧气味刺激调控局部慢波（slow-wave，SW）功率，即相较于uncued半球，cued半球的区域SW功率增加较慢，且与提示单词的选择记忆呈负相关。另外，在cued半球中，局部TMR改善了慢震荡和睡眠纺锤波间的相位振幅耦合（PAC）。在学习期间没有气味刺激条件下，睡眠期间进行单侧气味刺激，结果表明记忆表现和皮层睡眠振荡间并不存在任何效应。因此，睡眠中TMR通过选择性地促进与局部睡眠振荡相关的特定记忆，而超过了整体活动。
引言
研究表明，睡眠对记忆巩固很重要，在清醒时编码的新的和不稳定的记忆转化为不太稳定的表征，这些表征被整合到预先存在的知识中。根据系统整合的标准模型以及它的一些后续变化，依赖海马记忆的整合发生在两阶段的过程中，其中清醒时，在海马中编码新的记忆，然后在涉及与新皮质的交互过程（主要在非快速眼动（NREM）睡眠期间）中进一步巩固。这种海马-新皮质间的通信可能涉及新皮质慢波（SWs）、丘脑-皮质睡眠纺锤波和海马尖波涟漪（SWRs）间的协调耦合。根据这个模型，皮层SW上行状态促使海马SWR和神经元的重新激活。海马重新激活诱导延迟的皮质反应，促进向逐渐增强的依赖新皮质的转变。同时，睡眠纺锤波为皮层回路提供可塑性。因此，SW-spindle-SWR事件的分层嵌套可能会促进从新激活的海马记忆向各自的新皮质网络发生转化。
有研究表明，在NREM睡眠期间的记忆巩固可以通过重新的刺激（如，与学习期间进行特定气味或声音）进行外部调节。“目标记忆再激活（TMR）”这种方法可以促进记忆巩固并诱导海马活动，这表明涉及重新激活新的记忆或其中一部分。虽然气味和声音都是有效刺激，但气味的好处是很少唤醒睡眠受试者。
然而，TMR中一个主要没有解决的问题是，选择性记忆对皮层睡眠振荡产生的影响是局部的还是整体的。目前并不清楚潜在的局部效应，为了克服这个问题，理想情况下，人们会在选定的皮层区域进行特定刺激，而将其他区域的同步活动作为控制。有研究明确了局部睡眠振荡的概念及其与记忆巩固的关系。因此，原则上，皮层睡眠振荡可能因局部TMR区域而存在差异。
为了对与特定大脑区域活动相关的特定记忆进行TMR，本文利用嗅觉系统的独特功能神经解剖学，其刺激处理主要是同侧的。嗅觉记忆是可以存储在一个半球中，只有通过连合通路才能进入另一半球。由于在NREM睡眠期间跨皮质区域的有效连接减少，本文假设睡眠期间跨皮质半球的整合可能会受到损伤。因此，本文预测在睡眠中向单个鼻孔进行气味刺激会增强记忆并调节同侧半球相关的睡眠振荡。
基于上述理论，本文在睡眠时通过对单个鼻孔进行气味刺激来局部激活单个半球的记忆（图1）。这种方法可以评估局部刺激对相应半球的行为记忆和电生理影响，而与另一半球相关的记忆和活动作为对照组（图1A）。本文使用了一个空间记忆任务，该任务需要对单词和左右视觉特定位置间的配对联系进行编码，这些联系与对侧大脑半球的处理相关（图1C、1D和1F）。结果表明，通过单侧嗅觉刺激在睡眠中的局部TMR超过了整体效应，并改善了与局部皮层睡眠振荡相关的选择性记忆。

图1 实验设计。（A）试验过程的时间示意表。（1）受试者首先在对两个鼻孔进行气味刺激的情况下，学习word-location关联。（2）学习后，立刻进行记忆测试。（3）受试者在实验室小睡（~1-2h）。在NREM睡眠期间，通过特制面罩对单个鼻孔进行气味刺激。（4）睡眠后，进行记忆测试。（B）从左到右：学习期，对两个鼻孔进行气味刺激；在记忆测试期，不带面罩和没有气味刺激；睡眠期，进行单个鼻孔气味刺激；记忆测试期，不带面罩和没有气味刺激。（C）学习实验的时间线。单词依次出现在屏幕中心，并朝八个圆形目标之一移动。（D）记忆测试时间线。单词依次出现在屏幕中央，受试者使用光标选择与每个单词相关的目标位置。绿色虚线表示示例光标的轨迹。（E）“单侧鼻孔面罩”展示。（F）术语说明：睡眠期间，气味传递到cued鼻孔（本例中是右鼻孔）。同侧半球就是cued半球（嗅觉通路主要是同侧的）。学习过程中，与cued半球对侧视野中的目标位置（本例中是左侧视野中的目标）相关联的单词是cued单词（视觉通路主要是对侧的）。（G）对照实验的时间示意表。在没有任何嗅觉刺激的情况下进行记忆编码，随后在睡眠期间进行单侧气味刺激。
结果
在睡眠期间通过单侧嗅觉刺激进行TMR，以探究它如何影响提示记忆和相应的局部睡眠振荡。本文使用cued/uncued半球来分别指睡眠期间受刺激鼻孔的同侧/对侧半球。cued/uncued单词分别表示在cued半球的对侧/同侧视觉呈现的单词刺激，本文预测单侧提示能改善主要在刺激鼻孔半球处理的记忆巩固，呈现在对侧视觉（图1F）。气味和单个单词的处理不仅限于一个半球。因此，本文还进行了一项对照实验，受试者在没有气味刺激的情况下进行记忆编码，然后在睡眠期间进行单侧嗅觉刺激（图1G）。该对照实验可以确定哪些行为和电生理效应源于睡眠中的单侧嗅觉刺激和由单侧TMR引起的。
学习时的侧化EEG活动表明单半球记忆过程
首先，本文测试了任务是否在记忆编码期间引发了侧化脑活动。随后，本文检测了任务学习期间的脑电图（EEG）（图1A-1C中的记忆编码）是否显示侧化活动及其随学习过程的动态。本文采集30名受试者（参与对照实验）的EEG数据，他们记住了在六轮学习中重复的32个word-location关联。比较了每个单词目标位置的对侧/同侧中央电极（C3和C4）中的事件相关电位（ERP），在前三轮（“早期学习”）和后三轮（“后期学习”）学习中分别进行实验。本文发现对侧和同侧ERP的振幅在早期和后期学习轮次中显著不同，表明在任务学习期间存在侧化EEG活动（图2A和2B；早期：t=8.938，p<10-5；后期：t=8.064，p<210-5；Monte-Carlo permutation test[MCPT]）。随后测试三个不同的实验期，以检验它们对这种效应的贡献：单词出现在屏幕中心（0-800ms）；单词朝目标位置移动（目标放大+单词移动；800-1350ms）；单词到达目标位置（1350-1750ms）。在早期和后期学习轮次，对侧和同侧ERPs只有在单词移动（图2A；t=3.706；p=0.006）和单词到达目标位置期间（t=11.261；p<10-5；MCPT）存在显著性差异，可能表明了当单词移动并到达目标位置时的侧化视觉处理。然而，在后期学习轮次中，对侧和同侧ERPs在三种不同实验期都存在显著性差异（图2B，单词在屏幕中心：t=2.985，p=0.018；单词移动：t=6.879，p=210-4；单词到达目标位置：t=9.509，p<10-5）。重要的是，侧化性在后期学习实验中出现得更早，并在单词移动前/间更明显（图2C和2D；单词在屏幕中心和移动期间的600-800ms，t=2.477，p=0.007and t=2.321，p=0.016；MCPT）。因此，在后期学习阶段，一旦发生一些学习行为，EEG就会显示出更早的侧化活动，此时单词还在屏幕中心。这种较早的侧化现象解释了单词与其左/右视野中的相应位置间的关联的电生理关系。额叶和顶枕叶EEG显示相似的结果。总之，本文在任务期间发现EEG的明显侧化随学习过程而增加，与假设一致，即任务涉及单半球记忆过程。

图2 任务学习期间的EEG侧化性。（A）在每次实验中，同侧电极（粉色）和对侧电极（绿色）的学习任务的前三轮中，中央EEG ERP（n=30）时间锁定到单词呈现。阴影表示标准错误。黄色突出显示同侧和对侧ERP之间存在显著性差异的区域（p<0.05）。（B）与（A）相同，只不过是表示后三轮学习。在后期学习期间，同侧和对侧ERP出现更早的差异。（C）早期学习和后期学习轮次的ERP侧向比较（同侧和对侧ERP间差异的均方根[RMS]）。（D）分别在学习任务的早期（亮绿圈）和后期（暗绿圈）学习轮次中的单词在屏幕中心（600-800ms）和目标放大及单词移动（800-1350ms）条件下，每个受试者数据的同侧和对侧ERP间的平均误差（红条）。后期学习轮次的同侧和对侧ERP间的差异更大，反映了侧化记忆过程。
睡眠时的局部TMR选择性地改善大脑半球相关记忆
立即评估训练后（pre-sleep）和小睡后（post-sleep，_{2.5h）的word-location关联的记忆（}5min）。为了测试TMR对cued单词记忆的影响，本文进行了一项双向重复测量方差分析，包括时间条件（pre-sleep/post-sleep）和线索条件（cued/uncued）。发现时间（F(1，18)=2.847；p=0.109）和线索（F(1，18)=0.049；p=0.827）都不存在显著性效应，但是时间和线索间存在显著的交互作用（F(1，18)=8.579；p=0.009）。这种相互作用反映了对cued单词的记忆维持（two-tailed paired t test；t(18)=-0.956；p=0.352），但是对uncued单词的记忆在睡眠后显著降低（two-tailed paired t test；t(18)=2.842；p=0.011；effectsize：Cohen’s d=0.652）。非参数统计进一步证实了对cued单词（Wilcoxon sign-rank=48.5；Z=-1.024；p=0.306）的记忆是稳定的，而对uncued单词的记忆下降（Wilcoxon sign-rank=114；Z=-2.415；p=0.016；effectsize：rank biserial correlation [RBC] r=0.484）。为了进一步评估记忆表现，将每个受试者的post-sleep记忆表现归一化为pre-sleep表现（set to 100%）。结果（图3A）表明，睡觉后，对cued单词的记忆（mean）比uncued单词（mean）的记忆更好（t(18)=3.05，p=0.007，effect size：Cohen’sd=0.699；Wilcoxon sign-rank=145，Z=2.593，p=0.009，effect size：RBCr=0.674），在大多数受试者中都是这样（13/19）。
相比之下，对照实验中的单侧气味刺激没有表现出显著的行为效应。由于一名受试者的异常分数（图3C中用黑色标出），使分布偏离了正态，本文报告了除他之外的数据的参数检验，以及包括该受试者的非参数检验。双向重复测量ANOVA显示在时间和嗅觉刺激间不存在显著的相互作用（F=1.74；p=0.205）。“cued”（mean）和“uncued”（mean）单词间的归一化post-sleep记忆表现不存在显著性差异。对cued和uncued单词的记忆进行非参数检验同样没有显著性差异（图3C；Wilcoxon sign-rank=40；Z=-1.728；p=0.084）。为了确定本文观察到的行为效应是由单侧TMR操作引起的，本文进行了混合ANOVA，将实验（TMR/control）和视野（cued/uncued）作为参数，发现二者间存在显著的相互作用（F(1,36)=9.257；p=0.004）。通过非参数检验来比较每个受试者在不同实验中的视野得分的差异，这种相互作用也是显著的（Z=3.008；ranked sum=474；p=0.003；Wilcoxon ranked sum test）。
本文通过主观评分测量了睡眠后气味的感知强度，以测试睡眠期间的气味刺激是否会影响其他认知方面。在TMR实验中，感知气味强度与N2睡眠期间的30s气味刺激的数量成正相关（参数：rp=0.672，p=0.001；非参数：rs=0.649，p=0.002；图3B）。而对照组实验中并不存在相关性（参数：rp=0.083，p=0.734；非参数：rs=0.033，p=0.892；图3D）。本文还证实了，不论是左鼻孔还是右鼻孔提示，或是左视野和右视野的关联间，记忆表现都没有显著差异。
总之，行为结果表明，当气味在学习过程中作为刺激并在睡眠中重新单侧呈现时，它会影响气味的表现并改善与特定半球处理相关的记忆。

图3 睡觉期间，单侧气味刺激的行为效应。（A）在TMR实验中，cued单词（紫色，左）和uncued单词（灰色，右）的post-sleep记忆测试。用线连接的圆圈表示每个受试者的数据。黑线表示对cued单词的记忆更好（13/19名受试者）；虚线表示对uncued单词的记忆更好。（B）TMR实验中，睡眠后主观气味强度等级间的相关性（y轴）是N2睡眠期间30s气味刺激时期（cues）数量（x轴）的函数。（C）对照实验中的cued单词（紫，左）和uncued单词（灰，右）的post-sleep记忆测试的比较并没有显著效应。（D）对照试验中，睡眠后的主观气味强度等级（y轴）是N2睡眠时期30s气味刺激时期（cues）的数量（x轴）的函数，但是并没有相关性。
睡眠期间的局部TMR调节跨半球的EEG SW和纺锤波频率
为了测试单侧气味刺激是如何调节皮质睡眠振荡的，本文首先评估了30s气味刺激时期（“odor-on”）较基线时期（“odor-off”）的EEG频谱功率改变（图4A和4E）。在脑电中央电极上，本文发现气味刺激显著增加了两个半球和两个实验的SW（0.5-4Hz）功率（TMR实验，图4B；cued半球：Wilcoxonsign-rank=144，Z=1.972，p=0.049，effect size: RBC r=0.516；uncued半球：Wilcoxon sign-rank=159，Z=2.576，p=0.01，effect size：RBCr-0.674；对照实验，图4F：cued半球：Wilcoxon sign-rank=167，Z=2.879，p=0.004，effect size：RBCr=0.758；uncued半球：Wilcoxonsign-rank=175，Z=3.219，p=0.001，effect size：RBC r=0.842）。
仅在TMR实验中，两个半球的纺锤波（12-16Hz）功率明显增加（图4B和4F：cued半球：Wilcoxon sign-rank=195，Z=2.576，p=0.01，effect size：RBCRBC-r=0.674；uncued半球：Wilcoxonsign-rank=157，Z=2.495，p=0.013，effect size：RBC RBC-r=0.653）。对照实验中，单侧嗅觉刺激并不会显著调节纺锤波功率。因此，SW功率受嗅觉刺激影响，而纺锤体功率仅在涉及记忆再激活时升高。
随后，本文使用两种方式测试了cued半球和uncued半球间的功率差异：首先，TMR实验中，cued半球较uncued半球的SW功率呈现少量增加（Wilcoxon sign-rank=31；Z=-2.575；p=0.01；effectsize：RBC r=-0.674）。对照实验显示同样的结果（图4G；Wilcoxon sign-rank=47；Z=-1.932；p=0.053；effectsize：RBC r=-0.505）。将SW分为SO和delta波表明，在uncued半球中更高的功率受delta波（1-4Hz）升高的影响（TMR实验：Wilcoxon sign-rank=34，Z=-2.455，p=0.014，effect size：RBCr=-0.642；对照组实验：Wilcoxon sign-rank=29，Z=-2.656，p=0.008，effectsize：RBC r=-0.695）。两半球间的基线水平都没有显著差异，表明cued半球中的较低SW功率不受基线调节。两半球间的纺锤波功率增加没有显著性差异。其次，使用cluster-based permutation across time-frequency bins比较由气味刺激引起的半球间的功率改变。在TMR实验中，发现在气味刺激的13-20s期间，uncued半球存在一个明显具有高SW功率的cluster（图4A中的红圈：clusterstatistics=-347.546；p=0.003），对照组实验中并没有显著的clusters（图4E）。
为了评估实验类型（TMR/control）和半球（cued/uncued）间的交互作用，从每个受试者的uncued侧减去cued侧的SW功率增加，并比较实验间的这些差异分数。本文发现纺锤波功率升高存在显著性相互作用（Z=-2.248；ranked-sum=293；p=0.025；Wilcoxon rank-sum test；使用Wilcoxon rank-sum test在SW中并没有发现交互作用）且在额叶电极的SW的相互作用存在显著cluster（clusterstatistics=-237.858；p=0.015；two-samplecluster permutation test；在中央电极或测试纺锤波时并没有显著的cluster）。这些结果表明，半球间的EEG功率差异由单侧TMR引起的。
在TMR实验中，本文发现SW功率改变和记忆间存在关系，在cued半球的SW功率和对cued单词的记忆提高呈负相关（rs=-0.49；p=0.033；图4D）。因此，在cued半球中SW功率越低，关联记忆越好。相反，在uncued半球中气味引起的SW功率与对uncued单词的记忆提高没有相关性（rs=0.107；p=0.664）。在SO频段（对cued单词的记忆和cued半球的SO功率：rs=-0.513，p=0.025；对uncued单词的记忆和uncued半球中的SO功率：rs=0.165，p=0.5；使用one-tail Fisher r-to-ztransformation计算相关性间的差异：z=-2.074，p=0.019），SW功率和记忆的相关性更强，但不包含delta波。在对照实验中，睡觉期间的功率改变和记忆表现没有任何相关性（图4H）。
因此，在TMR实验中，气味刺激差异性的调节cued和uncued半球中的SW功率，cued半球中越低的SW功率增加与该半球选择cued单词处理的记忆相关。

图4 睡眠期间单侧气味刺激引起的EEG功率改变。（A-D）为TMR实验中的结果。（A）睡眠期间气味刺激引起的cued（左）和uncued（右）半球的中央EEG功率改变的时频分解（在761个时期和19名受试者中取平均）。黑条表示30s的气味刺激。红圈表示半球间存在显著差异。（B）SW（左）和纺锤波（右）活动中中央EEG的功率改变，对两个半球取平均。白圈表示受试者。（C）在cued半球（紫，左）和uncued半球（灰，右）的SW功率的平均变化。实线/虚线分别表示在cued半球具有较低/较高的功率。（D）对cued单词的post-sleep记忆的回归散点图（pre-sleep基线的百分比；y轴）和在气味刺激期间的cued半球的SW功率（基线的SD；x轴），二者呈负相关。（E-H）为对照组实验结果。（E）对照试验中，在睡眠期间有气味刺激引起的对cued（左）和uncued（右）的中央EEG功率变化的时频分解（n=678时期和19名受试者）。（F）对两个半球的上的中央EEG SW（左）和纺锤波（右）取平均，得到对照实验的功率变化。气味刺激不会提高纺锤波功率。（G）对照实验中，SW功率在cued半球（紫，左）和uncued半球（灰，右）的平均变化。（H）气味刺激期间，对cued单词的post-sleep的回归散点图和cued半球中的SW功率，显示二者没有显著相关性。
在睡眠期间，局部TMR跨半球差异性调节SOs和纺锤波间的相位振幅耦合
本文测试了单侧气味刺激是否会影响睡眠纺锤波和前额电极SO上行状态间的相位振幅耦合（PAC），这和记忆巩固有关。通过分析在气味刺激期间SOs的典型相位，本文发现纺锤波紧挨着SO上行状态（图5A；平均优选相位值为0，所有试验和电极中，相位范围为-67°和15°之间）。Rayleightest for non-uniformity证实存在紧密的SO-spindle 耦合（TMR实验，cued 半球：Z=7.842，p=1.772×10-4；uncued半球：Z=8.66，p=5.667×10-5；对照组实验，cued半球：Z=5.18，p=0.004；uncued半球：Z=4.656，p=0.008）。
为了评估单侧气味刺激如何影响PAC，本文在每个实验中分别比较了半球间的SO-spindle PAC（图5B和5C）。本文使用一种within-subject、within-session的方法，将cued半球的PAC和同时出现在uncued半球的PAC进行比较。使用参数和非参数circular data 2-sample测试，来测试半球间标准化优选相位的差异。本文发现，在TMR实验中，优选相位存在显著性差异（Watson-Williams test：F=10.297，p=0.003；common-mediantest：p=12.7368，p=3.585×10-4）。大多受试者（15/19）的结果表明cued半球的优选相位比uncued半球发生得晚（图5B）。气味停止期间半球间的优选相位并没有显著性差异。对照实验中，半球间的PAC不存在显著性差异。PAC效应与功率调节不存在相关性，说明这些都是独立的现象。总之，本文发现单侧TMR导致在SOs和纺锤波间存在不同的PAC，cued半球中的前额皮层的纺锤波发生得更晚。对中央电极的PAC分析，同样表现出相似特征。

图5 睡眠期间的单侧气味刺激的相位振幅耦合。（A）跨实验（TMR实验，深色；对照组，浅色）和半球（cued半球，紫；uncued半球，灰）的前额EEG电极中SO上行状态相位周围的纺锤波振幅峰值。圆圈表示每个受试者的优先相位，绿条表示跨实验和半球的优先相位的直方图，红线表示平均相位（角度）和矢量（半径）。（B）TMR实验中，cued半球和uncued半球的平均标准化优先相位。（C）对照组实验的平均标准化优先相位，此时半球间没有显著性差异。
讨论
本文使用局部TMR来增强与单个脑半球处理相关的记忆。确认学习范式产生单侧大脑半球记忆过程的侧化EEG标记后，睡眠期间的单个鼻孔气味刺激为重建睡眠前的学习内容，并导致对选定单词的记忆巩固的差异效应。单侧气味刺激调节两个半球间的区域睡眠振荡。在气味刺激期间，两个半球的纺锤波和SW功率都增加，但是SW功率在cued半球增加更慢，且与对cued单词的记忆提高呈负相关。睡眠纺锤波与SO上行状态间的时间耦合，与依赖睡眠的记忆巩固有关，并在局部发生变化，即在cued半球，纺锤波更晚达到峰值且接近SO峰值。对照实验测试了结果是由局部TMR还是仅仅由睡眠期间的单侧气味刺激引起的。在学习期间并没有气味刺激，结果表明在cued半球和uncued半球处理单词时的记忆表现并没有差异。气味刺激在睡眠期间能提高SW功率（即使不进行TMR实验），但是这种功率增加与记忆表现无关，且其在半球间明显不同。除此之外，睡眠期间，纺锤波不受单侧气味刺激影响，表明纺锤波效应与学习相关。最后，在进行配对（within-subject）分析时，对照实验中的SO-spindle PAC在cued半球和uncued半球间并没表现出一致性变化。通过单侧TMR实验证实实验类型（TMR/control）和半球（cued/uncued）间的相互作用。总之，结果表明睡眠中进行局部TMR超过了只有睡眠期间单侧气味刺激的影响，并通过选择性地促进与区域睡眠振荡相关的特定记忆巩固并超越整体影响。
在最近的几轮学习中，当一些学习已经发生时，大脑半球的侧化ERPs已经在实验早期变得不同（然而单词刺激仍然呈现在屏幕中央），表明word-location关联的记忆过程主要发生在大脑半球。学习时的侧化EEG活动表明记忆过程主要是单半球的。
本文结果与TMR和局部睡眠振荡有什么关系？对cued单词的记忆在睡觉前和睡觉后表现出相似结果，而对uncued单词表现出明显的记忆减退。本文通过选择性地调节局部振荡和改善对相应单词的记忆。本文研究与局部记忆重激活一致，并对其使用单独的解剖路径来阐明局部处理：单侧气味刺激能控制得到提示的区域，并将它们与未得到提示的处理平行记忆的同源区域进行比较，从而更详尽地分离和研究睡眠中的记忆重激活过程。
本文发现SW功率在cued半球增加得更慢，且与对cued单词的记忆呈负相关。可能是由于单侧气味刺激选择性处理与EEG不同步和较低SW功率相关的cued半球。也就是说，cued半球的活动可能代表整体SW功率增加和局部SW功率降低的叠加。因此，越少的SW功率增加表示对cued刺激具有更好的记忆。
本文结果表明睡眠纺锤波和SO上行状态间的时间耦合是有效的依赖睡眠的记忆巩固的非侵入性代替。本文认为局部TMR影响SO-spindle耦合：与uncued半球相比，cued半球的纺锤波振幅峰值出现更晚和接近SO峰值（up-state），强调睡眠振荡的区域质量及其与记忆的巩固的关系。
虽然受试者无意识的感知到，N2睡眠期间气味刺激次数与随后在TMR实验中对气味强度的主观评价显著相关。但在对照实验中并未观察到此现象，说明可能不是与受体受气味相关的纯粹生理效应。想反，睡眠期间与记忆相关的气味提示可能会影响刺激表征，超出对记忆巩固的影响。也可能是睡眠期间，TMR的气味刺激是第二次接触气味（而不是对照试验中第一次）。事实上，反复接触气味会降低某些气味剂的检测阈值，而感知阈值的相似变化可能是本文观察到的影响的基础。
总之，本文报道的一种新的非侵入性技术，用于特定区域记忆的局部TMR，为睡眠和记忆研究以及潜在的临床应用开辟了新的途径。例如，单侧睡眠TMR可用于调节创伤后应激障碍（PTSD）中被侧化的创伤记忆的不同成分或帮助侧化脑损伤（如单侧中风）患者进行康复。
方法
受试者
32名健康受试者参加TMR实验（18名女性，mean age27.873.8岁，range 21-46），另外32名健康受试者参加对照实验（17名女性，mean age 27.284.71岁，range 21-41）。所有受试者都没有精神、神经、睡眠或呼吸障碍史，都是有良好的习惯性睡眠者和以希伯来语为母语的人。排除标准为(ⅰ)NREM睡眠时间不足（<20min）（TMR实验中排除10名受试者，对照实验中排除11名受试者），或（ⅱ）气味传输系统有问题（TMR实验中排除2名受试者，对照试验中排除1名受试者）或行为记忆数据有问题（TMR实验中排除1名受试者，对照实验中排除1名受试者）。对剩余受试者进行后续分析（TMR实验：n=19，10名女性，meanrange21-30；对照实验：n=19，10名女性，mean=27.64.3years，range 21-38）。
实验程序
TMR实验
在图1A和1B中给出了目标记忆再激活（TMR）实验过程的概述。受试者在下午12:00-14:00间到达实验室。高效空气净化器保证受试者处于无异味环境。受试者进行空间记忆任务的训练，同时通过覆盖两个鼻孔的面罩传递双侧气味刺激（图1B）。5min后进行没有气味面罩的记忆恢复测试（图1B）。随后，对受试者安装多导睡眠电极和单独鼻孔面罩，在床上睡两小时（图1B和1E）。在NREM睡眠期间，对一个鼻孔施加玫瑰气味刺激（受试者左右鼻孔刺激间平衡，n=10和9）。醒来后，~15min的恢复，受试者进行post-sleep记忆测试。该测试中的气味刺激强度和在任务和睡眠中的强度一样。总实验时长约4.5h。
对照实验
对照实验和TMR实验类似，只不过在学习期间没有气味刺激（图1G）。在NREM睡眠期间，单侧气味刺激出现30s，和TMR实验一样。另外，在初始学习任务期间进行EEG采集，依据10-20导联系统采集6个头皮电极：F3、F4、C3、C4、PO3和PO4。两个EOG电极，一个在眼睛下方，一个在眼睛侧面，记录眨眼和运动，以便去除伪影。对所有30名受试者（16名女性，mean age26.96 years，range 20-38）在清醒学习期间分析ERP的侧向性。
记忆任务
学习阶段
每个trail从固定期开始，固定期为白色十字出现在黑屏中央，八个小的八边形为目标（200ms、400ms或600ms、伪随机）。随后，白色单词出现在屏幕中央（800ms），然后将目标之一放大（400ms）。然后，单词逐渐变小朝目标移动，目标逐渐变大（150ms）。最后，在下一trail开始之前，单词完全移动到目标框内（400ms）。受试者需要记住单词和目标位置间的关系（图1C）。每个目标接收到的单词数量一样。单词都是常见的希伯来语的具体名词（3-5个字母）。在TMR实验中，13名受试者记住了32个单词的word-location关系，6名记住了48个单词的关系。对照实验中的受试者记住了32个word-location关系。目标被分为左视野4个圆圈，右视野4个圆圈，用于左右半球处理（图1C）。受试者需要始终注视屏幕中央的十字。单词分为两个block，每个block包含16个单词（学习了48组关系的受试者的单词分为24个为一个block），并在6轮学习中重复。受试者间的单词顺序、word-target关系，word-block分配都是随机的，只有一个限制：同样的目标位置不能连续出现两次，以限制与同一位置关系词间形成认知联系。在每个block后进行非海马“分心”任务（从屏幕上出现的三位数字开始，以三步的方式大声倒数），以最大限度地减少主动记忆并尽可能保持视觉记忆。每轮学习后都会有一分钟的停顿。根据试点实验（n=28名受试者）确定学习轮次，睡前成功率约为60%（chance level为12.5%）。只有在TMR实验中，在整个学习blocks中，通过鼻罩将玫瑰气味传递到两个鼻孔（而不在分心任务blocks和休息间期）（图1B）。在每个学习block后，受试者通过按两个按钮中的一个来说明他们是否能在任务期间闻到气味（mean=93.3%0.12of 12 blocks）。
记忆测试
在两个实验中，学习后立刻进行记忆测试（pre-sleep记忆测试），并在睡觉后~15min进行记忆测试（post-sleep记忆测试）。每个测试trail（图1D）都以八个目标和白色十字都出现在屏幕开始（200ms、400ms、600ms、伪随机）。然后，一个单词出现在屏幕中间（2500ms），之后，一个白点光标代替这个单词，受试者可以使用计算机触摸板将其移向与这个词关联的目标。当光点靠近目标时，目标会逐渐变大到中等大小，当在触摸板上确定是该目标时，目标会变得更大并持续2500ms直到下一trail开始。受试者如果不记得有10s去选择目标。10s后，如果没有选择目标，下一trail开始（图1D）。不会告诉受试者选择是否正确。单词以随机顺序出现。在post-sleep记忆测试阶段没有气味刺激（图1A和1B）。
气味刺激
在相邻房间准备一气味机器，连接管道，管道另一端为面罩（清醒和睡觉佩戴的面罩不一样）。气体流速为每分钟5L(lpm)。只有在TMR实验中的面罩覆盖两个鼻孔（图1B，左）。在TMR和睡眠期间使用的面罩能分离鼻孔的嗅觉环境。
睡觉期间的气味刺激
在TMR实验和对照实验中都会在睡觉期间进行气味刺激。在整个睡眠阶段，实验者监测多导睡眠图以识别睡眠阶段并提供气味刺激。在至少10分钟的睡眠后开始进行气味刺激，并且受试者要保持NREM睡眠。只要受试者有一点觉醒信号就停止刺激。刺激遵循30s-on/30s-off的模式以减少习惯。
多导睡眠图和睡眠评分
在睡眠期间使用PowerLab监测系统以1KHz的采样率和50Hz陷波滤波器采集得到生理测量。根据10-20导联系统，得到C3、C4、F3、F4的EEG信号，参考电极位于对侧乳突A2和A1。EOG位于每只眼睛上方或下方和侧面1cm处，参考电极位于对侧乳突。EMG位于双侧颏下肌附近。心电图电极位于腹部左侧和右侧，参考电极位于左脚上的接地电极。使用两个肺活量计分别测量鼻孔的鼻呼吸。根据2012 American Academy of Sleep Medicine（AASM），分别由两名评分员在线对睡眠阶段进行视觉评分。得到实验组和对照组的睡眠参数，包括睡眠潜伏期、总睡眠时间和不同睡眠阶段的时间。
EEG数据分析
使用0.5Hz的FIR高通滤波（Hamming窗和transition band为0.5Hz）对EEG信号进行滤波，以去除噪声。随后对其使用30Hz的FIR低通滤波（Hamming窗和transitionband为2Hz）去除高频噪声。对于PAC分析并没有进行滤波，以最小化信号失真。滤波后，信号降采样到250Hz并分为REM睡眠时期和NREM睡眠时期。预处理后，所有后续EEG分析都基于NREM睡眠时期。
本文将每个‘odor-on’30s期间归一化为‘odor-off’30s期间的功率，以便将无气味时期作为基线，从而计算两个半球间的功率变化。为了确保半球间的差异不是基线差异的结果，本文首先在以下频段使用Wilcoxon signed rank tests比较了半球间最后25s的‘odor-off’期间的功率：SW（0.5-4Hz）、SO（0.5-1Hz）、delta（1-4Hz）和spindles（12-16Hz）、前额电极和中央电极。半球间的这些比较都没有显著性差异（all p>0.2）。
使用事件相关光谱扰动（ERSP）对动态光谱进行分析，实现如下：分别对每个通道，围绕气味刺激提取55s间期（25s‘odor-off’基线时期，随后为30s‘odor-on’时期）。使用FIR滤波器（Hamming窗）将信号分为0.5Hz频率bins（59 bins0.5-30Hz）。对每个频率bins进行希尔伯特变化，随后归一化到前面的25s基线。然后，对每一受试者分别提取所有气味刺激的中值归一化功率。对所有受试者和trails进行ERSP平均，如图4A、4E所示。为了进一步量化气味刺激引起的功率变化，并在半球间比较这种变化，评估了感兴趣频段的功率：SW（0.5-4Hz）、SO（0.5-1Hz）、delta（1-4Hz）和spindles（12-16Hz）。另外，使用non-parametric cluster-based permutation testing进行测试。
检测慢波（SO）振荡事件
使用基于光谱内容和持续时间的定制脚本，用已建立的检测算法，自动检测单个SO时间。使用双向最小二乘FIR滤波将每个单独通道的脑电信号带通滤波到SO频率范围（0.5-1Hz）。两个过零点间的负偏转为一个半波。下一阶段只考虑连续过零点相隔0.25-1.0s的波。然后提取正负峰值振幅。最后，将15%的最高振幅（从负到正的峰值）事件认为是SO事件。将SO事件定义为距离负峰值2.5s。
检测睡眠纺锤波事件
对于睡眠纺锤波的检测和与SO相关的PAC分析，本文使用未过滤的原始数据来排除可能影响PAC分析的潜在相位失真。首先，使用过滤带宽为2Hz的零相位双向最小二乘FIR滤波器，在纺锤波范围（12-16Hz）内对NREM脑电信号进行带通滤波，用希尔伯特变换计算信号包络。对其使用高斯核（s=40ms）进行平滑。在所有NREM睡眠信号中，当包络幅度超过每个电极和每个受试者分别计算的mean+3SD的检测阈值时，就认为检测到该事件。将在1s内检测到的事件合并。将信号超过NREM睡眠期间纺锤波功率的阈值mean+1SD确定为事件开始/结束。持续时间在0.5s到2s之间的事件用于下一分析。为了降低检测到虚假纺锤波的概率，使用对无噪声的原始信号的快速傅里叶变换来计算检测到的事件的频谱功率。仅考虑与相邻频带（7-9Hz和18-20Hz）相比，峰值频谱功率在纺锤波频率范围（12-16Hz）内的事件，以避免宽带功率增加的事件。
SO-spindle相位幅度耦合
通过在单侧气味提示（‘odor-on’）期间检测到的SO事件子集，检测睡眠纺锤波发生的优先SO相位。首先对锁相数据进行滤波（双向最小二乘FIR滤波）得到SO成分（0.5-1Hz），希尔伯特变换提取瞬时相位角。然后对同样的锁相数据进行滤波得到纺锤波（12-16Hz），用希尔比特变换提取瞬时振幅。时间范围为-2到2s以避免滤波器边缘伪影。对每个受试者、通道、事件检测最大纺锤波振幅和相应的SO相位角。对每个受试者的通道计算mean circular direction，以确定‘优选相位’。
量化和统计分析
对行为数据和PAC进行参数和非参数统计。由于对照实验中有一名受试者的分数导致数据不是正态分布，所以参数统计并没有包含该受试者，而非参数统计包含该受试者。将时间（pre-sleep/post-sleep）和提示（cued/uncued）作为因素，通过双向重复测量ANOVA分析评估睡眠期间记忆表现的变化，然后使用双尾配对t检验和Wilcoxon sign-rank tests进行事后比较。随后，将个体post-sleep记忆表现标准化为pre-sleep记忆表现（pre-sleep表现设置为100%），并使用配对t检验和Wilcoxonsign-rank test比较双侧间单词记忆变化。使用Cohen’s d和非参数rank-biserial correlation（RBC）计算得到效应大小。使用Pearson和Spearman相关评估气味刺激时期数和刺激强度间的相关性。使用参数（two-way，mixed design ANOVA）和非参数（计算cued和uncued分数间的个体差异，并使用Wilcoxon ranked-sum test对实验间分数进行比较）检验测试实验类型（TMR/对照）和单词刺激的视野（cued/uncued）间的相互作用。
将四个trail间隔中对侧和同侧ERP间的RMS差异量化为ERP侧向化（图2）：Entire-trail（0-1750ms）、Word-at-center（0-800ms）、Word moving-to-target-location（target enlargement+word-moving，800-1350ms）和Word-at-target-location（1350-1750ms）。为了测试是否具有显著统计性（图2A和2B），将真实数据与1000000个代替样本进行比较，随机混合受试者内的对侧和同侧标签，随后计算RMS差异。通过计算两个任务的‘ERP侧向化’间的差异，来测试后三轮学习任务中的ERP侧向化是否大于前三轮学习（图2C）。
非参数统计检验用于EEG功率谱分析。对气味刺激期间的标准化EEG活动进行单样本Wilxocon sign-rank检验，以测试气味刺激对EEG功率的影响。使用Spearman相关来测试SW功率和记忆改善间的相关性，使用单尾Fisher r-to-Z变换检验相关性间的差异。使用聚类校正的跨时频bins的非参数置换检验探究半球间的振荡功率差异。对所有测试进行1000次随机迭代Monte-Carlo permutation方法。
使用CircStat toolbox计算circular统计，用于SO-spindle耦合分析。首先使用Kuper two-samples检验比较所有通道中受试者的‘preferred-phases’分布与von Mises分布没有显著差异。然后使用Rayleigh tests测试均匀性。随后，使用参数Watson-Williams多样本检验和非参数common-median检验来测试equal circular means。使用参数Watson-Williams测试和非参数common-median检验比较实验间每个半球preferred-phases间的差异，来评估PAC上实验类型（TMR/对照）和半球间（cued/uncued）的相互作用。