水凝胶 静电纺丝_简评：静电纺丝去细胞肌肉源性支架的制备与表征

 近年来，去细胞基质(dECM)在组织工程中的应用备受关注，已经成为一种具有开发价值的生物源性材料。dECM来源于自体、异体或异种动物组织，通过去污剂(例如TritonX100、EDTA、脱氧胆酸钠等)或高低渗溶液反复洗脱等流程清除细胞成分，如核酸等具有免疫原性的物质，同时保留了原本组织的生物化学信号，仍具有募集细胞、刺激细胞增殖和分化的功能。对于大体积肌肉缺损(VML)，肌肉源性去细胞支架的植入治疗在临床上已得到较好的效果。研究表明肌肉脱细胞支架有效促进了缺损组织中的成肌反应、血管的形成和神经连接的重建。但是，支架形状和尺寸对组织缺损部位较低的匹配程度一直限制着其临床应用，因此去细胞基质加工方法的创新将成为组织工程的研究方向。

 去细胞基质通过酶消化成溶胶，以其温度响应特性在37℃下自组装转化成特定形状的水凝胶支架。然而，在消化过程中胰蛋白酶在一定程度上破坏了基质分子链的微结构和降低了基质成分的活性。dECM水凝胶同时存在着机械性能差的缺点，使用交联剂能提高水凝胶的力学性能，但往往导致水凝胶网络孔隙变小的问题，进而阻碍宿主细胞的迁入和营养物质的渗透。虽然水凝胶支架的形状和大小可以根据损伤部位尺寸进行调节，但是水凝胶缺乏天然组织的各向异性微结构，难以提供组织细胞所需的物理引导信号。在恰当的张力环境下，肌肉细胞可根据基底结构中取向的拓扑信号进行成肌分化并形成成熟的肌管。所以，一种具有仿生结构和优异力学性能的去细胞基质支架在肌肉组织工程中将具有巨大的应用价值。

      最近，德克萨斯大学奥斯丁分校Mikos课题组成功将肌肉脱细胞基质通过静电纺丝技术制备得到微纳米纤维，利用旋转接收器接收纤维，赋予纤维的取向结构，实现了去细胞基质物理结构的可控性(Tissue Engineering Part C: Methods.May 2019.276-287)。在dECM静电纺丝工艺中关键的步骤有二，首先是去细胞基质要以微粒( 300 μm，50目)的形态溶解在HFIP中，在4℃下搅拌至没有聚集性颗粒可见为止。颗粒太大导致材料的分散性差，容易聚集成团和胶状物。其次是对溶液进一步地均质分散，但文中没有分享具体的操作细节，有可能是用球磨机或者匀浆机辅助分散。文中用到的纺丝溶液浓度是10 %，但溶解时间没有交代，可能是因为肌肉去细胞基质存在着批次间成分和含量差异大的问题，纺丝溶液加工窗口的把握仍需经验来指导，所以我认为去细胞基质具有可纺性的溶液状态仍需要进一步的研究和表征。作者也尝试在较低浓度下进行静电纺丝，能得到直径较小的纤维。由于成分和分子量分布的复杂性，获得直径分布较窄以及宏观形貌平滑的去细胞基质静电纺丝纤维膜具有一定的挑战性。在过去的研究中，有人尝试将膀胱去细胞基质应用到静电纺丝中，在不同的浓度下进行实验，低浓度溶液得到的纤维是含有串珠结构，高浓度溶液得到直径分布较宽的表面比较粗糙的纤维聚集体。为了得到表面光滑和直径分布均匀的纤维，很多工作选择掺杂合成聚合物来提高去细胞基质溶液的稳定性和可纺性。所以，不需要聚合物的辅助条件下实现去细胞基质的静电纺丝是该工作的亮点。

 该工作制备了无交联的无序纤维(RO)和有序纤维(AO)，以及戊二醛熏蒸处理的交联的无序纤维(ROX)和有序纤维(AOX)，先后研究了纤维的溶胀特性、降解性和力学性能。

图1. A)白兔后肢肌肉组织 B)肌肉去细胞基质 C)去细胞基质静电纺丝纤维 D)串联质谱法测定DECM静电纺丝膜的蛋白种类与含量 E~H)天然肌肉组织、dECM粉末和dECM静电纺丝膜中DNA、总蛋白质、硫酸糖胺聚糖和胶原含量的比较。

 往纺丝液加入荧光小分子并纺进去细胞基质纤维中，通过共聚焦观察到发绿光的无序/有序纤维。将四组材料泡在37℃的PBS中24 h，纤维吸水膨胀后直径变大，交联处理的纤维直径均低于未交联组，表明脱细胞基质纤维的结构稳定性需要交联反应来增强。用共聚焦显微镜Z轴等距扫描纤维膜，得到的图像通过ImageJ灰度处理，统计白色纤维占画面的面积并求出平均值，得到纤维膜的孔隙率：

                  ε = 1 -(A_fiber /A_total)

 吸水后纤维支架的孔隙率有所降低，与单根纤维的膨胀现象有关，但交联样品的孔隙率与未交联的没有显著性差异。可能地，未交联纤维吸水膨胀的同时经历着降解过程。

图2. 共聚焦观察发光的无序/有序去细胞基质纤维及其吸水膨胀后纤维直径、支架孔隙率的变化。相同字母表示组间没有显著性差异。

  去细胞基质纤维膜的降解性能分别通过水解和酶解降解实验来探究，介质分别是PBS和含有125 U/mL胶原酶的PBS。将四组材料分别浸泡在介质中，在37℃、轻微振荡的条件下降解，一周更换两次介质，在预设时间点(6h、12h、1d、2d、7d、14d、28d、56d)拿出样品冻干后称重。结果显示：

① 交联纤维的降解速率比未交联纤维慢，表明交联可增强dECM纤维的结构稳定性。

② 无序纤维的降解速率比有序纤维的慢，可能是无序纤维间接触点较多，结构较稳定。

③ 除了交联无序纤维组，其他纤维样品在24h内降解失重量都比较大，但降解过程仍可持续两个月。

图3. dECM支架在水解/酶解过程的质量变化。

  对于可植入性纤维支架来说，纤维结构在体内或体外降解过程中能否保持完整性，该工作没有用直观的图像来说明。可能地，去细胞基质静电纺丝纤维的性质如其他天然材料基纤维一样面临着降解快的问题，纤维结构在体内/外液体环境中的稳定性仍需要加强。

图4. 在不同种介质中肌肉去细胞基质静电纺丝纤维的形貌变化。

  对肌肉组织、去细胞基质静电纺丝纤维膜进行单轴拉伸测试，无序纤维组(RO~22kPa、ROX~185kPa)与肌肉组织(~116kPa)的拉伸模量没有显著差异。交联的取向纤维拉伸模量(~850kPa)比肌肉组织的大很多，表明交联度过高，应控制戊二醛熏蒸的处理时间来调节材料的力学性能。

图5. dECM支架的拉伸模量

  去细胞基质取自动物组织，具有高度的细胞相容性和生物活性，应用前景广阔。但是，这种生物源性材料存在着批次间成分与含量差异大的问题，例如动物组织的个体间差异、去细胞工艺流程以及后续材料加工过程中的波动性等；力学性能不足的问题，去细胞基质的再加工需要以溶液的形式进行处理，用到的强极性溶剂虽然会成功溶解dECM，但会对基质分子链或蛋白质结构造成一定的破坏从而削弱材料的结构强度，也会导致材料的水溶性增强。所以，对于材料来源和质量的管控、加工方法的创新和增强材料性能的研究仍需要不懈的努力。