文献阅读：猕猴的单个基底外侧杏仁核神经元表现出与额叶皮层不同的连接模式

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文献介绍

「文献题目」 Single basolateral amygdala neurons in macaques exhibit distinct connectional motifs with frontal cortex
「研究团队」 Peter H. Rudebeck（美国西奈山伊坎医学院）
「发表时间」 2023-10-18
「发表期刊」 Neuron
「影响因子」 16.2
「DOI」 10.1016/j.neuron.2023.09.024

摘要

基底外侧杏仁核（Basolateral amygdala, BLA）广泛投射到猕猴额叶皮层（frontal cortex），而杏仁核-额叶投射对于适当的情绪反应和决策至关重要。虽然人们认识到单个 BLA 神经元会分支并投射到额叶皮层的多个区域，但这种分支的组织和频率尚未完全表征。在这里，作者确定了 3000 多个猕猴 BLA 神经元的投射模式。作者发现三分之一的 BLA 神经元在额叶皮层和皮层下结构中有两个或多个不同的投射目标。单个 BLA 神经元投射到多个区域的模式被组织成重复的 motifs，靶向内侧和腹侧额叶皮层中的不同区域组，表明可分离的 BLA 网络。作者的研究结果开始揭示非人类灵长类动物大脑中单神经元连接的丰富结构，为 BLA 在协调全脑对情感刺激的反应中的作用提供了神经解剖学基础。

研究结果

MAPseq 使用 sindbis 病毒载体感染神经元，使其产生独特的 RNA 条形码。该方法的工作原理是，单个神经元最有可能只吸收编码独特 mRNA 条形码的单个病毒颗粒。这些 mRNA 条形码与非功能性突触前蛋白结合，因此在细胞体中表达，并沿着轴突运输到突触末端。然后，通过对注射位点和靶位点的样本进行解剖和测序，单神经元投射模式可以通过比较每个样品中发现的条形码列表来确定。

1. MAPseq 在猕猴中的验证

作者在两只猕猴的 BLA 中进行双侧 MRI 引导立体定向注射带条形码的辛德比斯病毒（Figure 1A）。灌注后，提取大脑，分离半球并切片。BLA 和额叶皮层（frontal cortex）、纹状体（striatum）、内嗅皮层（entorhinal cortex）、海马体（hippocampus）和丘脑内背侧核（MD）中的目标区域被解剖，根据灰质/白质边界以及脑沟标志（Figure 1B）。选择这组区域是因为它包含 BLA 到额叶皮层的主要投射目标。值得注意的是，因为选择了可能目标区域的子集（例如，作者没有剖析来自更多尾侧颞叶皮层的目标），不一定捕获每个测序神经元投射的完整范围。相反，所有结论均仅基于此处描述的一组目标。

(A)左图：注射方法示意图。右图：在冠状图谱上标注的实际注射部位（耳间距离单位为 mm）。在前部切片（19.5 mm）中，每只动物只在一个垂直轨道上进行注射；在后部切片（18 mm）中，每只动物在两个轨道上进行注射。半球 1 和 2（分别为红色和蓝色）来自一只动物，而半球 3 和 4 来自另一只动物（分别为黄色和绿色）。
(B)示例冠状切片显示纹状体以及额叶和颞叶的解剖靶点。Ento，内嗅皮层；HC，海马体（未显示）；AI，前纹状皮层；mOFC，眶上额皮质；lOFC，眶下额皮质；vlPFC，腹外侧前额叶皮质；scACC，前扣带前部；pgACC，周围带前扣带前部；dACC，背扣带前部；PMd，背侧运动皮质；NAcc，伏隔核；MD，中背核（同样未显示）。前后水平相对于耳间平面以 mm 为单位。
(C)barcode 计数相对于注射部位最大值在非注射部位杏仁核样本（蓝色）、所有靶结构（绿色）以及小脑对照部位（红色）中的分布。在杏仁核内表达的 barcode 显著多于远端靶点位点，而在靶点位点表达的条形码显著多于小脑对照组织，而杏仁核与小脑之间存在非常低的投射概率。
(D)每个 target 和 control 区域中 barcode 的比例；虚线表示在 control 区域中发现的 barcode 比例。
(E)在杏仁核外的零个（绿色）、一个（橙色）、两个（蓝色）或两个以上（红色）的靶标的唯一 barcode 比例。
(F)对于 10 个唯一 barcode（彩色线），在所有潜在的 target 和 control 区域中的 barcode 比例归一化。
(G)barcode 在区域 A 中同时也在区域 B 中被发现的条件概率。请注意，此处索引的顺序会改变 P(A|B) 大于 P(B|A) 的概率。

作者使用生物分析仪确认了组织样本中 RNA 的完整性，然后使用 qPCR 来确认条形码表达与管家基因相比是稳健的（Figure S2）。正如预期的那样，与来自额叶皮层的样本相比，作者在注射部位附近的杏仁核样本中恢复了明显更多的条形码，并且与来自小脑的对照样本相比，在额叶皮层中恢复了更多的条形码（Figure 1C)。作者特别选择小脑作为对照位点，因为杏仁核极不可能投射到大脑的这一部分。因此，条形码 mRNA 在猕猴神经元中表达，然后被转运到额叶皮层和其他大脑区域的轴突末端。

然后对从 BLA 和目标区域提取的 mRNA 进行高通量下一代测序。将提取的 RNA 中的独特条形码计数标准化为 spike-in 序列（即，添加到每个样本中的已知 RNA 序列以控制样本之间的 PCR 效率），并应用阈值来控制虚假测序结果（Figure S3）。然后对四个半球的组合阈值条形码计数进行分析（分别参见