哈佛大学——差异表达分析（一）RNAseq基础知识

概述——使用Salmon计算

该课程的学习目标

1. 使用主成分分析（PCA）和层次聚类对计数数据进行质量控制
2. 使用DESeq2获得差异基因的列表
3. 可视化差异表达基因的表达模式
4. 使用基于R的工具对基因列表进行功能分析

需要下载的包

1. 使用install.packages("insert_package_name_in_quotations")，从CRAN下载包：

BiocManager
devtools
tidyverse
RColorBrewer
pheatmap
ggrepel
cowplot

2. 使用

library(BiocManager)
install("insert_first_package_name_in_quotations")

从Bioconductor下载包：

DESeq2
clusterProfiler
DOSE
org.Hs.eg.db
pathview
DEGreport
tximport
AnnotationHub
ensembldb

工作流程（原始数据计数）

学习目标

理解从RNA提取到评估基因表达水平这一整个RNA-seq工作流程的不同步骤。

RNA-seq工作流程

为了进行差异基因表达（DGE）分析，我们需要一个代表基因表达水平的计数矩阵(count matrix)。在统计分析前，更重要的是要理解计数矩阵是如何产生的。
接下来简单介绍bulk RNAseq的RNA-processing pipeline，以及我们从原始测序读段(reads)到基因表达计数矩阵所需的不同步骤。

1. RNA提取和文库准备

在对RNA进行测序之前，必须先将其提取并从细胞环境中分离出来，然后制成cDNA文库。下图概述了其中涉及的许多步骤，同时还进行了各种质量检查，以确保我们拥有高质量RNA能继续实验。我们在下面简要介绍其中一些步骤。

1. RNA富集(Enriching for RNA)
   用DNA酶处理样品以去除污染的DNA序列后，样品将进行mRNA的选择（polyA选择）或rRNA的去除。
   通常，rRNA是细胞中占比最多的RNA，而mRNA仅占总RNA的一小部分，人类约2％。因此，如果要研究蛋白质编码基因，则需要富集mRNA或耗尽rRNA。对于差异基因表达分析，最好富集Poly(A)+，除非打算获取有关lncRNA的信息，在这种情况下，建议去除核糖体RNA。

RNA质量检查：在开始cDNA文库制备之前，必须检查提取的RNA的完整性。传统上，通过目测经凝胶电泳的核糖体RNA条带来评估RNA的完整性。但是这种方法既费时又不精确。安捷伦(Agilent)的生物分析仪系统将快速评估RNA完整性并计算RNA完整性数（RIN），这有助于RNA质量的解释和再现性。RIN本质上提供了一种方法，通过该方法可以将来自不同样品的RNA质量以标准化的方式相互比较。

2. 片段化及大小选择(Fragmentation and size selection)
   第二步将剩余的RNA分子片段化。可以通过化学，酶促（例如，RNA酶）或物理过程（例如，化学/机械剪切）来完成。然后对这些片段进行大小选择，仅保留那些在Illumina测序仪可以处理的最佳大小范围内（即150至300 bp之间）的片段。

片段大小质量检查:在选择/排除片段大小后，应该评估片段大小分布，以确保它是单峰的和良好定义的。

3. 将RNA逆转录为双链cDNA(Reverse transcribe RNA into double-strand cDNA)
   可以通过创建链库(stranded libraries)来保留有关片段起源于哪条链的信息。最常用的方法是在合成第二条cDNA链时掺入脱氧-UTP（有关详细信息，请参阅Levin et al.（2010））。一旦产生双链cDNA片段，就将接头（adapters）连接到末端。 （可以在此处而不是在RNA水平上进行大小选择。）
4. PCR扩增(PCR amplification)
   如果起始材料的量少和/或为使cDNA分子的数量增加到足以进行测序的量，则通常PCR以扩增文库。运行尽可能少的扩增循环，以避免PCR伪像。
   
   图片来源：Nat Immunol. 2012 Sep;13(9):802-7.

2. 测序（Illumina）

cDNA文库测序将会产生读段（reads）。读段对应于文库中每个cDNA片段末端的核苷酸序列。可以选择对cDNA片段的单端（single-end reads）或片段的双端（paired-end reads）进行测序。

SE - Single end dataset