哈佛大学——差异表达分析（十）Wald检验结果解读

学习目标

1. 讨论为两两比较(Wald检验)生成结果表所需的步骤
2. 总结不同水平的基因过滤
3. 解释log倍数变化收缩（log fold change shrinkage）

探索结果（Wald test）

默认情况下，DESeq2使用Wald检验来识别两个样本类之间差异表达的基因。考虑到设计公式中使用的因子，以及存在的因子水平的数量，我们可以提取一些不同比较的结果。在这里，我们将介绍如何从dds对象获取结果，并就如何解释这些结果提供一些解释。

注意:Wald检验也可以用于连续变量。如果在设计公式中提供的感兴趣的变量是连续值，那么报告的log2FoldChange 是该变量的每单位变化。

指定的对比（Specifying contrasts）

在我们的数据集中有三个样本类，所以我们可以进行三种可能的两两比较:

1. Control vs. Mov10 overexpression
2. Control vs. Mov10 knockdown
3. Mov10 knockdown vs. Mov10 overexpression

我们只对上面的第一条和第二条感兴趣。当我们创建dds对象时，我们提供了~ sampletype作为设计公式，表明sampletype是我们感兴趣的主要因素。
为了指出我们想要比较的两个样本类别，我们需要指定对比（contrasts）。对比用作DESeq2 results()函数的输入，以提取所需的结果。
对比可以用两种不同的方式来表示(第一种更常用):

1. 对比可以作为一个字符向量，包含三个元素:设计公式中(感兴趣的)因素的名称，两个要比较的因素层次的名称。最后给出的因素水平是进行比较的基础水平。语法如下:

# DO NOT RUN!
	contrast <- c("condition", "level_to_compare", "base_level")
	results(dds, contrast = contrast)

2. 对比可以以2个字符串向量的列表：感兴趣基因倍数变化水平的名称，基线水平倍数变化名称。这些名称应该与resultsNames(object)的元素相同。该方法可用于组合交互项和主效应。

# DO NOT RUN!
	resultsNames(dds) # to see what names to use
	contrast <- list(resultsNames(dds)[1], resultsNames(dds)[2])
	results(dds, contrast = contrast)

或者，如果你只有两个因素水平，你可以什么也不做，而不用担心指定对比(即results(dds))。在本例中，DESeq2将根据level的字母顺序选择你的基础因子水平。
首先，我们要计算MOV10过表达样本和对照样本之间的表达变化。因此，我们将使用第一种方法来进行对比，并创建一个字符向量:

## Define contrasts for MOV10 overexpression
contrast_oe <- c("sampletype", "MOV10_overexpression", "control")

我选择什么作为base level有关系吗?

是的，这很重要。决定哪个level是base level将决定如何解释所报告的fold change。例如，如果我们观察到-2的log2倍的变化这意味着基因表达在相关因素水平上比基础水平更低。因此，如果把它留给DESeq2来决定对比，一定要检查字母顺序是否与你预期的fold change方向一致。

结果表

现在已经创建了对比（contrast），可以使用它作为results()函数的输入。让我们快速看一下这个功能的帮助手册:

?results

你将看到，我们可以选择提供大量的参数，并根据需要调整默认值。在我们学习这节课的过程中，我们会不断回到帮助文档来讨论一些值得了解的参数。

## Extract results for MOV10 overexpression vs control
res_tableOE <- results(dds, contrast=contrast_oe, alpha = 0.05)

注意:对于我们的分析，除了contrast参数外，我们还将为alpha参数提供一个0.05的值。当我们谈到基因水平过滤（gene-level filtering）时，将更详细地描述这一点。

返回给我们的结果表是一个DESeqResults对象，它是DataFrame的一个简单子类。在许多方面，它可以被视为一个数据框(即在访问/提取子集数据时)，但是重要的是要认识到在可视化等下游步骤中存在差异。

# Check what type of object is returned
class(res_tableOE)

[1] "DESeqResults"
attr(