SARS-CoV-2+scRNA｜找到一篇单细胞转换成伪Bulk分析的文章了

说在前面

之前有位粉丝跟我讨论过单细胞转伪Bulk的做法，小编以前是有看过有人这样干过的，还发的一区十来分的文章但没Mark住，现在找到一篇相近做法的，可以看看

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今天给大家分享一篇JCR一区，单细胞的文章：Single-cell RNA sequencing reveals characteristics of myeloid cells in post-acute sequelae of SARS-CoV-2 patients with persistent respiratory symptoms

• 标题：单细胞RNA测序揭示了SARS-CoV-2后续并发症患者中单核细胞的特征
• 期刊名称：Frontiers in Immunology
• 影响因子：7.3
• JCR分区：Q1
• 中科院分区：医学2区
• 小类：免疫学2区

摘要

背景：尽管我们对COVID-19疾病的免疫病理学及其后续风险和严重程度的理解正在不断发展，但关于导致COVID-19感染长期肺部并发症的免疫反应的详细描述仍不清楚。很少有研究详细描述了与持续肺部症状有关的SARS-CoV-2感染后续并发症（PASC）的免疫和细胞因子谱。驱动COVID-19幸存者和PASC患者肺部后续症状的免疫系统失调仍然大部分未知。

结果：为了表征肺部PASC（PPASC）的免疫特征，我们进行了基于微滴的单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究，以研究来自对SARS-CoV-2天然免疫的参与者（对照组）（n=1）和感染了SARS-CoV-2并患有慢性肺部症状（PPASC）（n=2）的外周血单个核细胞（PBMCs）的转录组学特征。在将scRNA-seq数据与已发表的数据集中的一个对SARS-CoV-2天然免疫的参与者进行整合后，根据经典标记的表达确定了11个明显的细胞群体。与对照组相比，PPASC中髓系细胞谱（MLCs；CD14/CD16单核细胞和树突状细胞）的比例增加。PPASC中的MLCs表现出与肺部症状/纤维化相关的基因的上调，而糖酵解代谢相关的基因则下调。同样，通路分析显示，PPASC中纤维化相关（VEGF，WNT和SMAD）和细胞死亡通路上调，但免疫通路下调。进一步比较PPASC与严重COVID-19的scRNA-seq数据（n=4）表明纤维化转录标记的富集。在PPASC中，我们观察到MLCs之间的交互性VEGF配体-受体对，并且CD14（簇4）和CD16（簇5）单核细胞中的网络模块显示出与不良COVID-19结局、纤维化和血管生成相关的生物通路的显著富集。进一步分析揭示了MLCs中代谢的明显改变，在PPASC中，与SARS-CoV-2天然免疫样本相比，糖酵解/糖异生的下调。

结论：对小型scRNA-seq数据集的分析显示了PPASC中免疫反应和细胞景观的变化。MLCs水平的升高及其与纤维化、免疫反应抑制和代谢状态改变相关的基因标记的存在，表明其在PPASC发展中可能具有潜在作用。

关键词：SARS-CoV-2；长期COVID；单核细胞；SARS-CoV-2感染后续并发症；肺部后续症状；单细胞RNA测序。

结果

图1 PPASC和对照组参与者的细胞类型分布和细胞类型比例分析。

• (A) 从PBMCs获得的单细胞RNA数据，包括PPASC（n=2）和对照组（n=2）中共有34,319个整合细胞。通过基因特征聚类，UMAP（统一流形逼近和投影）展示了所有合并样本和11种细胞类型。每个点对应一个单个细胞，并根据细胞类型着色。
• (B) 利用细胞标记数据库2.0中的经典标记基因的表达，对UMAP图中的聚类进行了注释。点图显示了标记基因的平均表达水平以及每种标记基因在标记的细胞类型中表达的细胞百分比。点图中的行对应于每个细胞簇中高表达的选定标记基因。
• © 对PPASC（n=2）和对照（n=2）组的每个细胞类型的细胞比例进行了手动计算。通过饼图将结果可视化。
• (D) 采用排列测试和自举法来比较PPASC（n=2）和对照（n=2）组中各个细胞类型的比例，以检测细胞比例的统计学差异。点图显示了PPASC与对照组中细胞比例的统计学显著性差异，呈现了PPASC相对于对照组的Log2FD分布。

图2 PPASC与对照组的差异基因表达、通路富集和转录因子富集分析。

• (A) 在PPASC（n=2）中与对照组（n=2）相比，CD14和CD16单核细胞和树突状细胞群体中的差异表达和上调基因，其中选择性标记了与纤维化相关的基因，通过散点图可视化。
• (B) 在PPASC与对照组中，CD14和CD16单核细胞和树突状细胞群体中的差异表达和下调基因，其中包括与糖酵解相关的基因，通过散点图可视化。统计学上显著上调的基因用红色点表示，统计学上显著下调的基因用蓝色点表示，对于(A, B)两者都是如此。
• © 比较PPASC与对照组之间的功能性通路分析。通过散点图可视化在所有免疫细胞类型中PPASC相对于对照组富集的基因集通路，按照选择性通路类别进行分组。上调的通路用红色点表示，下调的通路用蓝色点表示。
• (D) 基于DoRothEA的靶基因数据库推断出在所有细胞类型中PPASC与对照组之间富集的差异性转录因子，通过热图可视化（红色；上调，蓝色；下调）。与纤维化相关的转录因子在MCLs中一致富集的被标记为红色。

图3 PPASC与对照组中VEGF信号通路、细胞间相互作用和通路富集分析。

• (A) 计算了CD14和CD16单核细胞以及树突状细胞中细胞间配体-受体相互作用和VEGF信号通路相互作用的几何表达，在PPASC（n=2）和对照组（n=2）之间进行比较。在x轴上显示了具有统计学显著性和可比性的细胞间相互作用几何表达，‘P’和‘C’分别表示PPASC和对照组。
• (B) 单细胞细节包括VEGF配体-受体基因在PPASC和对照组中CD14和CD16单核细胞以及树突状细胞中的平均和百分比表达。红色表示高表达，靠近圆形表示在细胞类型簇中的高百分比表达。
• © 为了验证，聚合的单细胞表达数据被处理为伪块，并在PPASC与对照组中的CD14和CD16单核细胞以及树突状细胞中对VEGF配体基因进行了差异表达测试（红色；上调，蓝色；下调）。

图4 PPASC组中单核细胞基因模块表明CD14单核细胞存在促纤维化偏向。

• (A) 构建了CD14和CD16单核细胞在PPASC（n=2）和对照组（n=2）中的基因相关网络。利用UMAP聚类降维方法将细胞聚类到每个相关网络中的网络模块中。每个网络模块格式化为五个簇。
• (B) 在PPASC和对照组的CD14和CD16单核细胞中，利用Wilcoxon统计框架对每个网络模块进行了差异表达测试。
• © 在差异表达的网络模块4和5中进行了富集通路测试。结果可视化为点图，选择性通路类别标记为功能性富集的通路。红色点表示上调，蓝色点表示下调，点的大小表示组合得分的对数折叠变化。

图5 两个PPASC个体中MLCs中的代谢基因特征。

• (A) 利用通路签名基因集进行基因集变异分析（GSVA），评分每个细胞中平均通路分数。在PPASC（n=2）和对照组（n=2）中，选择性地研究了CD14和CD16单核细胞以及树突状细胞中与糖酵解相关的通路。结果为每个组拆分并可视化为小提琴图。
• (B) 在CD14和CD16单核细胞以及树突状细胞中，利用Cohen’s D统计框架对糖酵解中的差异代谢反应进行测量。结果以火山图呈现，每个点代表糖酵解代谢中的一个反应。
• © 测量并可视化了糖酵解代谢物相互作用中的表达和丰度，呈现为小提琴图，展示了MLCs之间的代谢物丰度和传感器基因表达。
• (D) 推断了MLCs中细胞间糖酵解代谢物相互作用的评分，每个细胞间通信呈现为点图。

小结

• 主要数据及方法：

Types	Notes
分析数据	scRNA：GSE149689
分析方法	Seurat单细胞标准流程；MAST差异分析；Hallmark基因集富集；DoRothEA转录因子富集；细胞通讯；伪bulk差异分析；单细胞网络；Compass代谢分析
实验技术	单细胞外周血分离、分选和测序

• 总的来说，单细胞就是单细胞，bulk就是bulk。前者最大的优点就是区分细胞类型，以细胞为个体，特别是肿瘤异质性强，混在一起很难得出好结果。不过作者这里的做法不完全是伪bulk分析，只是提取了单种细胞子集做了两组间差异分析而已
• 小编之前做过的转伪bulk是好像有十来个样本，整合了每个样本的细胞表达，做成行为基因名列为样本名的表达矩阵。也仅大部分情况是：找了很久只有这个相对匹配的数据集，只能转成bulk来做bulk的分析，但其实本人并不推荐这种做法，有点像取其糟粕，去其精华