m6anet_pipeline-CSDN博客

本文链接：https://blog.csdn.net/weixin_50917712/article/details/141602494

github地址：https://github.com/GoekeLab/m6anet

1. 环境准备

1.1. 创建独立的工作目录

目的：为了将m6Anet分析的所有相关文件集中管理，避免与其他项目混淆。
操作

mkdir ~/m6anet_project
cd ~/m6anet_project

1.2. 安装Python 3.7及以上版本并创建环境

目的：确保m6Anet及其依赖项能在适合的Python环境中运行。
检查Python版本：
```
python3 --version
Python 3.6.8
```
安装Python并激活环境

conda create -n m6anet_env python=3.8
conda activate m6anet_env

1.3安装m6Anet分析所需其他软件

Python 3.7+
m6Anet
Minimap2
Nanopolish
Samtools
Multi_to_single_fast5（如果使用multi_read_fast5文件）
Gffread

由于镜像，网络，权限等各种原因，实在不行就只能手动下载gz文件然后自行编译安装了！

Minimap2

 tar -xvzf minimap2-2.28.tar.gz
 cd minimap2-2.28
 make
 ./minimap2 --version
# 2.28-r1209
 echo $HOME/bin
#添加全局路径。如果你没有将 minimap2、nanopolish 或 samtools 添加到全局路径（即 /usr/local/bin/ 或其他在 PATH 环境变量中的目录），你将需要每次使用这些工具时，指定它们的完整路径。
 echo $HOME/bin
/share/home/maliuyin/bin
#这里你可以忽略，你可以选择以下两种方法之一来管理和使用你的软件工具：

方法 1：直接将软件的安装目录添加到 PATH 中；方法 2：将软件的可执行文件放到 ~/bin 目录，并将 ~/bin 添加到 PATH 中
nano ~/.bashrc
export PATH=$PATH:/share/home/maliuyin/m6anet_project/software/minimap2-2.28
source ~/.bashrc

Nanopolish

优先conda安装

#清华和中科大的镜像已经被用爆了，北京外国语的也可以
conda config --add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/pkgs/main/
conda config --add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/pkgs/free/
conda config --add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/pkgs/r/
conda config --add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/pkgs/pro/
conda config --add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda/
conda config --add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge/
conda config --set show_channel_urls yes
#重新使用conda安装一下吧
conda install -c bioconda nanopolish

#centos检查有无依赖项
rpm -qa | grep -E 'zlib-devel|bzip2-devel|xz-devel|libcurl-devel'
#zlib-devel-1.2.7-18.el7.i686
libcurl-devel-7.29.0-54.el7.x86_64
xz-devel-5.2.2-1.el7.x86_64
bzip2-devel-1.0.6-13.el7.x86_64
zlib-devel-1.2.7-18.el7.x86_64
#我的系统有所有依赖项
tar -zxvf nanopolish-0.14.0.tar.gz
cd  nanopolish-0.14.0
make

samtools

conda install -c bioconda samtools

Gffread

conda install -c bioconda gffread

安装 m6Anet： m6Anet 目前可能还没有直接在 bioconda 上提供，因此你需要通过 pip 来安装

pip install m6anet
m6anet --help
#安装依赖
conda install cython
conda install gcc_linux-64 gxx_linux-64  # 对于 Linux 系统
pip install m6anet

Multi_to_single_fast5

multi_to_single_fast5 通常是 ont-fast5-api 软件包的一部分，可以通过 Conda 来安装：

conda install -c bioconda ont-fast5-api

2. start work

以下流程中的路径和文件需要注意修改为自己的

2.1提取转录本序列 (`gffread`)

gffread ../Genome/AU9_XY.gff3 -g ../Genome/AU9_XY.20230207.fasta -w ../Genome/AU9_XY.transcripts.fasta

2.2将 `multi_read_fast5` 文件转换为 `single_read_fast5` 文件 (可选) (`multi_to_single_fast5`)

multi_to_single_fast5 -t 20 -i ./test_data/multi_read_fast5 -s ./test_data/single_read_fast5 --recursive

解释：将多个读段存储在同一个 .fast5 文件中的数据转换为每个读段一个 .fast5 文件。某些工具（如 nanopolish）可能需要单独的 fast5 文件。
验证：如果你的 .fast5 文件是 multi_read 格式，这一步是必要的。

2.3为比对后的读段建立索引 (`nanopolish index`)

nanopolish index -d ./test_data/single_read_fast5 ./au9/fastq/pass.fq.gz

解释：为原始信号文件（.fast5 文件）和 fastq 文件建立索引，使 nanopolish 能够快速访问数据

2.4序列比对 (`minimap2` 和 `samtools`)

minimap2 -ax map-ont -L --secondary=no -t12 ../Genome/AU9_XY.transcripts.fasta ./au9/fastq/pass.fq.gz | samtools view -bh -F 2324 | samtools sort -O bam > ./test_data/basecalls.bam
samtools index ./test_data/basecalls.bam

解释：使用 minimap2 将读取的序列比对到参考转录组上，并使用 samtools 对结果进行处理，生成排序的 BAM 文件。

2.5生成 `eventalign.txt` 文件 (`nanopolish eventalign`)

nanopolish eventalign --reads ./au9/fastq/pass.fq.gz --bam ./test_data/basecalls.bam --genome ../Genome/AU9_XY.transcripts.fasta --scale-events --signal-index --summary ./test_data/m6anet_summary.txt  --threads 16 > ./test_data/m6anet_eventalign.txt

解释：nanopolish eventalign 通过比对的 BAM 文件生成 eventalign.txt 文件，包含原始信号的分段信息，这是 m6Anet 需要的数据。

2.6数据预处理 (`m6Anet dataprep`)

m6anet dataprep --eventalign ./test_data/m6anet_eventalign.txt --out_dir ./test_data/m6anet_output --n_processes 16

解释：使用 m6Anet 的 dataprep 功能预处理 eventalign.txt 数据，为修饰预测准备数据。

2.7预测 m6A 修饰 (`m6Anet inference`)

m6anet inference --input_dir ./test_data/m6anet_output --out_dir ./test_data/m6anet_output  --pretrained_model arabidopsis_RNA002 --n_processes 16 --num_iterations 1000