全长转录组概述--Iso-seq_1

前言 

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二代测序：边合成边测序SBS

PacBio测序原理：给DNA链加上adapter最后变为环状DNA片段，芯片有很多小孔每个要测的片段都能掉进一个小孔，孔底有DNA聚合酶。将DNA片段捕捉 ，另外一条链在合适条件下开始合成和illumina相同每合成一个碱基就会发光，它不需要桥式PCR，但是如果酶活下降也有弊端。

一个转录本RNA单链先逆转为双链cDNA。测序错误率为10%-15%单条reads,测序次数增加，假设待测2-3k总测量可达20-30k可测十次左右 ，对reads进行校正，准确性到达99.9%以上CCS测序技术。

2M200万nanopore测序长度可达k是千碱基单位

无参分析

Iso-Seq基本分析（全长转录组分析）

是什么：

Iso-Seq（Full-Length Isoform Sequencing）是一种用于分析和研究转录本的高通量测序技术。该技术旨在捕获和分析转录本的完整序列，包括转录本的全长和全序列信息。Iso-Seq 技术可以克服传统测序方法中的短读长限制，提供了更准确和更全面的转录本信息。

Iso-Seq 技术的主要步骤包括：

1. **cDNA合成**：从RNA样本中提取RNA，通过反转录过程合成cDNA，保留了转录本的完整序列信息。

2. **长读长测序**：利用长读长测序技术，如PacBio Single Molecule Real-Time (SMRT) 测序技术或Oxford Nanopore 测序技术，对cDNA进行测序。这些技术能够产生较长的读长，能够覆盖转录本的整个长度。

3. **数据分析**：对测序得到的长读长数据进行分析，包括数据的过滤、错误校正、拼接和注释等步骤，以获得转录本的完整序列。

Iso-Seq 技术的应用包括但不限于以下几个方面：

- **转录本组装**：将长读长测序数据用于转录本组装，可以得到更准确和更完整的转录本信息，特别是对于复杂的基因组。

- **转录本注释**：利用长读长测序数据对基因组中的转录本进行注释，发现新的基因和变体，研究基因的结构和功能。

- **转录本差异表达分析**：基于长读长测序数据，进行转录本的定量和差异表达分析，揭示基因在不同生物学条件下的表达模式和调控机制。

总的来说，Iso-Seq 技术为转录组学研究提供了一种全新的视角，能够更全面地理解和研究生物体内的基因表达调控网络。

（1）公司给的原始read是Subrerad,一条一条的。需要将这种read转为CCS read转换为一致性的read

上图是下载的三代测序数据每一条(m54193_190213_040038/5571256/241891_242197 )都是一个subread, 可以发现有很多subread前面的部分都一样（m54193_190213_040038/5571256），继续往下翻阅文件发现出现了不同（m54193_190213_040038/5636427）。前面都一样的代表转录之后同一个DNA片段，还原回去就是同一个转录本。简而言之，只要前面部分一样最终就会合并成为一条ccs序列。如果拿到的数据只有后面的（251532_251827）说明公司已经将subreads转为ccs了。

但是ccs序列仍然有很多我们不想要的序列，接头尾巴之类的。

 Isoform转录本是指来自同一基因的不同mRNA转录产物，它们可能由同一基因产生，但在转录或剪接等过程中发生了变异或修饰，导致它们的序列不同。

transcript和isoform，在生物信息学分析的时候有时候会混用，但比较清晰的一种理解是：转录本就是真实转录出来的一条RNA链，而isoform只是一种可变剪切形式。

一个基因上有多个外显子，可以有很多剪切形式isoform形成不同的转录本transcript。

举例：澳洲棉籽可以制油，很多棉制油不可食用

文件量级标准：

（1）CCS文件100万 

（2）Flnc65万 （30万-100万）一般项目水平

 可变剪切分析

差异可变剪切：有四个组织（处理），不同组织比较可变剪切差异。