10X空间转录组数据分析之automated image analysis

hello，大家好，今天我们要继续分享10X空间转录组的分析方法，今天我们的重点是解决一个很现实的问题，那就是10X空间转录组的spot通常情况下包含了多个细胞，但是如果细胞过大（比如脂肪细胞），那么spot的位置很可能就落在了细胞的间隙之间，如下如：

这种情况下，我们得到的spot的表达信息到底该怎么算呢？今天我们就来解决这个问题。用到的就是我们今天分享的automated image analysis，而我们的终极目的，就是能够将脂肪细胞（范例）大小数据与来自相应位置的基因表达谱整合起来。

这里稍微介绍一下背景，As fat cell size and number impact WAT（白色脂肪组织） function，determined these two parameters in relation to the identified adipocyte subtypes.This revealed that AdipoLEP was the most abundant cell class (median 23%), followed by AdipoPLIN (median 14%) and AdipoSAA (median 8%)（也就是说，白色脂肪组织里面有三种脂肪细胞，这三种脂肪细胞的大小和数量是存在差异的）。

In this relatively small cohort, comparisons of obese versus non-obese subjects showed that the former had fewer AdipoPLIN cells while the proportions of AdipoLEP and AdipoSAA were similar between the two groups(也就是说肥胖的人群AdipoPLIN cells数量比正常的少，其他两种细胞类型没有显著的差异)。In contrast, donor age did not impact the fraction of the fat cell subtypes（年龄对结果的影响也很小）。为了测试脂肪细胞亚型是否显示出细胞体积的差异，所以遇到了上述问题，而问题的解决就需要图片识别的方法，也就是automated image analysis，这么做的目的在于能够从所有脂肪细胞斑点的一个子集中提取数据，这些数据在各自的比例方面具有代表性

• 注：Number of spots assigned to AdipoLEP, AdipoPLIN, and AdipoSAA in the ten subjects by Visium (gray) and the subset of spots retrieved using image analysis (purple).

也可以获取their transcriptional profiles

最后and fat cell size assessments

• 注：Comparison of average fat cell diameters (mm) in collagenase-isolated fat cells analyzed by light microscopy and the image analysis. Data are shown for nine individuals as collagenase-isolated cell data were not available from one subject . Coefficient of determination (r2) and p value are shown for linear regression analysis.

这个分析，作者也说了细胞直径虽然变化较小但是显著的不同，AdipoPLIN (74 mm) were on average smaller than AdipoSAA (76 mm) and AdipoLEP (77 mm)。

• 注：Average fat cell diameter (mm) of AdipoLEP, AdipoPLIN, and AdipoSAA measured by image analyses in the ten subjects. Differences were determined by Friedman test and uncorrected Dunn’s post hoc test, where the asterisks indicate p < 0.05.

后续为了验证细胞的大小是否was a determinant of adipocyte subtypes，we next identified genes that were differentially expressed comparing small (1st quartile) versus large (4th quartile) fat cells.

图片.png

• 注：（左）Density plot showing the distribution in adipocyte diameter (mm) for AdipoLEP, AdipoPLIN, and AdipoSAA combined. Dotted lines indicate median as well as 25th and 75th percentiles; quartiles 1 and 4 (Q1 and Q4) are highlighted.(右)Volcano plots highlighting genes showing the most significant differences comparing large (Q4) versus small (Q1) adipocytes from the ten donors. The analysis was performed for all identified fat cells (left, top ten most significant genes highlighted), AdipoLEP (middle), and AdipoPLIN (right). There were too few AdipoSAA cells assigned to allow statistical analyses.

这表明 AdipoLEP 和 AdipoPLIN对细胞大小的差异有反应，尽管基因有些不同。

当然，综上所述，这些分析表明 (1) 脂肪细胞亚型的比例受肥胖影响，(2) 一组基因在比较小脂肪细胞和大脂肪细胞时表现出改变的表达，以及 (3) 而脂肪细胞亚型对脂肪细胞直径大小的变化有反应，但这本身并不能解释脂肪细胞的异质性。

而我们的重点，主要是如何根据图片提取细胞大小的信息，也就是Image-based fat cell size assessments

Adipocyte size determinations were performed for all spots attributable to the three adipocyte subtypes。For each segmentation, H&E 染色的图像被裁剪为 400 X 400 像素（1 像素 = 0.873 毫米），各自的 Visium 点坐标位于中心。 选择这些尺寸是为了确定图像足够大以包括用于后续分析的整个脂肪细胞。 使用 ImageJ 记录宏函数对生成的 6,655 张图像进行批量分析。 （真够拼的，怪不得可以发这么高的文章）。简而言之，在应用 Huang 暗自动阈值之前，使用 50 像素的滚动球半径和浅色背景进行背景减除（这部分是图片处理）,包含的粒子分析临界值是：最小面积为 2,000 像素，圆度高于 0.2（0 为直线，1 为正圆）和非边缘events(例如cells overlapping with the image border),使用随机选择的图像验证所有参数（上图）

通过选择与斑点中心距离最小的脂肪细胞来确定属于相应斑点的概率最高的脂肪细胞(原来如此)。 通过将最大到中心距离设置为 120 像素，将最大面积设置为 25,000 像素，在 R 中执行了进一步的过滤。 这些步骤能够排除错误分割的细胞以及距离点坐标太远的细胞。 为了比较大脂肪细胞和小脂肪细胞中的基因表达，数据被分成四分位数，差异表达的基因使用 Seurat v4.0.1 包的 FindMarker 函数确定，应用默认的 Wilcoxon 秩和检验。 有点机智啊😄。

这里给大家强调一点，ImageJ这个软件，大家必须要掌握。

生活很好，有你更好