半胱氨酸偶联修饰ADC药物的过程测定比例探讨-瑞禧

于基于半胱氨酸偶联的ADC,若重轻链间二硫键连接上药物，重轻链之间则通过疏水相互作用连接，即使在非还原变性条件下，重轻链之间容易发生分离;若重链之间的两对二硫键分别连接药物,同样也容易发生分离。

反相色谱基于ADC不同组分疏水性的差异对各组分进行分离,但是反相色谱填料对于蛋白有一定的变性作用，加之流动相里存在有机溶剂及少量的有机酸，容易对ADC发生破坏作用,可以使重/轻链或重/重链发生分离,大大增加分析的难度。

IgGl具有4对链间二硫键,单抗通过部分还原使链间二硫键转换成游离的半胱氨酸残基，半胱氨酸残基再与小分子药连接形成了一-种包含0~8个药物复合抗体的混合物。二硫键还原后可产生2个游离巯基,可同时连接2个药物,所以药物一般以偶数出现,因此基于半胱氨酸偶联的ADC一般来说为含有0,2,4,6或8个药物的混合物,其可能存在的形式如图所示。

 

在仪器分析前，将ADC用巯基乙醇充分还原,ADC样品则解离为0~1个药物的轻链以及带有0~3个药物的重链,然后利用反相色谱可对各组分进行有效分离。

PLRP-8色谱柱能够轻松实现对ADC各个还原片段的分离,通过质谱联用技术，对各峰进行鉴定。通过紫外吸收光谱计算各峰的峰面积百分比，得到ADC的加权平均DAR. RP-HPLC 的方法没有高浓度盐，不会对常规液相色谱系统造成污染，使用的是质谱兼容的流动相，能够兼顾质谱定性与液相定量计算DAR。此方法不仅可得到DAR,还可计算带有不同数目药物的重轻链的比例,对于基于半胱氨酸偶联ADC的DAR及药物分布分析具有重要意义。

按照药物偶联于抗体的位点分类,ADC可分为基于赖氨酸和基于半胱氨酸偶联2种用。IgG1抗体具有4对链间二硫键和12对链内二硫键,一般来说，半胱氨酸偶联技术只将药物偶联至链间二硫键的巯基上。温和的偶联反应可有效控制ADC的药物抗体偶联比(drug antibody ratio, DAR)，因为DAR是十分重要的质控参数,比例较低则药效降低。

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