单细胞测序学习笔记（一）——细胞聚类和鉴定

使用的是10X  Genomics

5k Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a healthy donor (v3 chemistry)

Single Cell Gene Expression Dataset by Cell Ranger 3.0.2

的数据

1.保持好习惯，先清空一下环境

rm(list = ls())

2. 读取下载的数据，文件夹中包括三个文件：1. barcodes.tsv 2. features.tsv 3. matrix.mtx,将这三个文件加载到环境中。

pbmc.data <- Read10X(data.dir =  "D:/myprojects/5k pbmc/5k_pbmc_v3_filtered_feature_bc_matrix/filtered_feature_bc_matrix")

3. 创建Seurat对象，counts为读取的源文件，project为Seurat对象想保存的文件名，可以加上限定条件：min.cells为组织中分离的最少细胞数，min.features为一个细胞中测出的最少的基因数量

pbmc <- CreateSeuratObject(counts=pbmc.data,project = "pbmc5k",min.cells = 3,min.features = 200 )

4. 查看一下pbmc的构成

> pbmc
An object of class Seurat 
18791 features across 4962 samples within 1 assay 
Active assay: RNA (18791 features, 0 variable features)

5. 进行质控

创建一列名为percent.mt的新数据，添加到pbmc中，使用PercentageFeatureSet函数（此函数可以计算每个细胞中每一细胞器的QC指标）计算线粒体基因占比

pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc,pattern = "^MT-")

%>%为管道函数，就是把左件的值发送给右件的表达式（暂存在内存当中，没有保存为对象在硬盘中）

6. 查看一下

[email protected] %>% head()
                   orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt
AAACCCAAGCGTATGG-1     pbmc5k      13536         3502       10.7
AAACCCAGTCCTACAA-1     pbmc5k      12667         3380        5.6
AAACCCATCACCTCAC-1     pbmc5k        962          346       53.1
AAACGCTAGGGCATGT-1     pbmc5k       5788         1799       10.6
AAACGCTGTAGGTACG-1     pbmc5k      13185         2886        7.8
AAACGCTGTGTCCGGT-1     pbmc5k      15495         3801        7.5

7. 将QC结果展示为小提琴图，features中的名称加引号，ncol=3表示图形分三列展示

> VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

8. 可以结合散点图一起进行极值细胞的筛选删除

plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")

9. 取极值删除后的子集

pbmc <- subset(