ECD和分子对接在生物大分子与手性分子相互作用研究中的应用

背景介绍

烯康唑是一种具有两个对映体的手性三氮唑类杀菌剂，广泛应用于植物病原体的防治。手性农药对映体以镜像形式存在，具有相似的元素和结构，但可能在环境中表现出不同的行为、生物活性、毒性和代谢特征。传统方法在评估手性化合物的危害性时，将其视为外消旋体是不全面和不准确的，使用生物活性更高、毒性更低的单一异构体可以减少这种危害性。

研究简述

青岛农业大学园艺学院团队从手性分子的角度切入，发现烯康唑的对映异构体作用于不同目标物种时存在明显的差异。他们运用电子圆二色谱（Electrostatic Circular Dichroism, ECD） 法确证了烯康唑两个对映体R-(+) 烯康唑 和S-(−)-烯康唑的绝对构型，并建立和优化了对映体分离方法，从分子水平上探讨了对映异构体的生物活性、生物毒性和立体选择性降解，为深入研究手性农药奠定了理论基础。

烯康唑是一种去甲基酶抑制剂，通过作用于植物中真菌病原体麦角甾醇生物合成途径中的14α-去甲基酶（CYP51），影响病原体细胞膜的生物合成，起到杀菌作用。研究者以中国三大主产区生产的苹果为试材，采用套袋技术，对苹果中的烯康唑进行了立体选择性降解实验。初步结果表明，S-(−)-烯康唑在苹果中的降解速度慢于R-(+)-烯康唑。S-(−)-烯康唑对4种目标植物病原菌均表现出较高的生物活性。急性毒性试验结果进一步表明，S-(−)-烯康唑对大型水蚤的急性生物毒性高于R-(+)-烯康唑。基于这些发现，研究人员通过分子对接技术验证了两个立体异构体在四种目标病原体作用下生物活性的差异，以及立体选择性生物活性的产生机制，建立了基于液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析方法的手性烯康唑分离方法，为手性农药的风险评估奠定了基础。

计算与结果分析

下文针对计算内容中的ECD方法和化合物与生物大分子的分子对接展开介绍。

电子圆二色谱（ECD）

电子圆二色谱（Electrostatic Circular Dichroism, ECD）对分子基团的空间取向非常敏感，能够提供手性分子的三维结构信息，是探索手性分子绝对构型的有力工具。 研究者在殷赋云平台（殷赋云 - 科研计算快易准) 上完成了ECD的计算，并通过拟合实验圆二色谱和理论电子圆二色谱，确定了烯康唑的绝对构型。如图1c所示，实验（虚线）和计算图谱（实线）拟合很好，波长200到220nm范围内呈现出对应的科顿效应（Cotton Effect），这是直线偏振光透过旋光性物质时产生偏转的现象，与文献所述“烯康唑具有明显的旋光度（Optical Rotation）”吻合。

图1. a）烯康唑对映体结构。b）烯康唑对映体的NMR图谱。c）烯康唑及其对映体的计算图谱（实线）和实验图谱（虚线）比较。

ECD操作简述

1. 准备化合物三维结构；

2. 使用系统搜索法进行构象分析；

3. 采用密度泛函DFT方法，在甲醇中进行几何优化；

4. 采用时间依赖的密度泛函理论（TD-DFT）计算电子激发态；

5. 采用多构象玻尔兹曼加权平均方法产生计算ECD谱，并与实验图谱拟合分析。

化合物与生物大分子的分子对接

为了从分子水平上了解烯康唑对映异构体R-(+) 烯康唑 和S-(−)-烯康唑的生物活性差异和潜在机制，研究者采用殷赋云平台（殷赋云 - 科研计算快易准) 的计算方案对烯康唑立体异构体和CYP51进行了分子对接。

分子对接操作简述

1. 制备受体蛋白：输入PDB编号（1EA1），处理生成良好的蛋白质三维结构。

2. 制备配体蛋白：利用UCSF的Chimera构建基于共晶配体氟康唑的烯康唑对映体结构。

3. 使用Vina计算方案进行分子对接，以配体的位置确定对接口袋。

4. 分析结合模式和作图。

如图2，两种异构体与CYP51结合模式的相同点如下：在活性口袋中有相似的结合构象，紧密的结合模式，咪唑环与水分子形成很强的氢键，与铁卟啉（HEME）形成金属配位键，苯环与HEME形成π-π堆积。

图2. 受体蛋白CYP51与R-(+)-烯康唑、S-(−)-烯康唑的结合模式与结合位置。

不同之处在于，R-(+)-和S-(−)-烯康唑与活性中心铁离子形成的配位键键长不同，分别为2.8 Å和2.7 Å，拥有较短键长的S-(−)烯康唑具有较强的结合力。与R构型相比，S构型不仅与氨基酸Phe255、Leu100和Arg96产生疏水作用，还与Phe83、Phe78和Tyr76形成疏水作用。此外，精氨酸Arg96侧链的胍基与 S-(−)-烯康唑的芳环形成了π-阳离子相互作用（图1B）。π-阳离子相互作用作为一种非共价力，在稳定蛋白质和芳香族配体的结合方面发挥着重要作用。R-(+)-烯康唑的结合力为−7.5 kcal/mol，S-(−)-烯康唑的结合力为−7.6 kcal/mol（表1）。显然，具有较低数值的S 构型具有较强的结合力。

表1. 烯康唑立体异构体与蛋白质CYP51的对接结果。

上述分子对接结果表明S-(−)-烯康唑与CYP51结合形成更多的相互作用，具有更强的结合力，因而，其生物活性也高于 R-(+)烯康唑，与实验结论一致。

此外，实验测得外消旋体构型Rac-烯康唑的生物活性值介于两个对映体之间，可以从对接结果获得解释。外消旋体是一种具有旋光性的手性分子与其对映体的等摩尔混合物。外消旋体的生物活性/毒性（结合力）实际上是两对映体的平均值。因此，上述对接结果及其平均值完美对应生物活性顺序：S-(−)烯康唑>Rac-烯康唑>R-(+)-烯康唑。

案例总结

本研究对手性烯康唑对映异构体的绝对构型、生物活性、作用机理、生态毒性和立体选择性降解进行了详细的研究，为手性农药的风险评估提供了科学指导依据，在促进农药的准确使用，提高农药的有效性，缓解环境和食品污染等方面具有重要意义。该成果已经发表在学术期刊Science of the Total Environment上。

REFERENCE

Ye Li, Jiyun Nie, Jia Zhang, Guofeng Xu, Hui Zhang, Mingyu Liu, Xiaoqin Gao, Bacha Syde Asim Shah, Ning Yin, Chiral fungicide penconazole: Absolute configuration, bioactivity, toxicity, and stereoselective degradation in apples, Science of The Total Environment, Volume 808, 2022, 152061, ISSN 0048-9697, Redirecting.