饲料中氨基酸的测定

最新推荐文章于 2024-08-29 02:52:14 发布

赵大喜.

最新推荐文章于 2024-08-29 02:52:14 发布

阅读量2k

点赞数 25

分类专栏：饲料中氨基酸检测的四种方法酸提取法碱水解法文章标签：其他

本文链接：https://blog.csdn.net/2302_76710391/article/details/140060903

版权

饲料中氨基酸检测的四种方法同时被 3 个专栏收录

1 篇文章 0 订阅

订阅专栏

酸提取法

1 篇文章 0 订阅

订阅专栏

碱水解法

1 篇文章 0 订阅

订阅专栏

【概述】

饲料中氨基酸的测定方法包括四种：普通酸水解法、氧化-酸水解法、碱水解法、酸提取法。

一、普通酸水解法

1.适用范围：

该方法适用于饲料原料、配合饲料和浓缩饲料中除了色氨酸、含硫氨基酸以外15种氨基酸的准确测定。

2.测定原理：

常规（直接水解法）是使饲料蛋白在110℃条件下，用6mol/L盐酸溶液水解成单一氨基酸，再经离子交换色谱法分离，并以茚三酮做柱后衍生测定。水解过程中色氨酸被全部破坏，不能测量，胱氨酸和蛋氨酸则部分氧化，使测定结果偏低。

3、仪器设备：

（1）分析天平：感量0.0001g。

（2）真空泵

（3）喷灯

（4）恒温箱或水解炉

（5）旋转蒸发器或浓缩器：可在室温至65℃调温，控温精度±1℃，真空度可低至3.3× $10^{3}$ Pa

（6）氨基酸自动分析仪：茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪，要求各氨基酸的分辨率大于90%

4、试剂与溶液：

（1）盐酸溶液：6mol/l

(2) 液氮

（3）稀释用柠檬酸缓冲溶液，pH2.2，c（Na+）=0.2 mol/L :称取柠檬酸钠19.6g,用水溶解后加入优级纯盐酸16.5ml，硫二甘醇 5.0ml，苯酚1g，加水定容至1000ml，摇匀，用G4垂熔玻璃砂芯漏斗过滤，备用。

（4）不用pH和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液：按氨基酸分析仪说明书配制。

（5）茚三酮溶液：按氨基酸仪器说明书配制。

（6）氨基酸混合标准贮备液：含L-天门冬氨酸、L-苏氨酸等17种常规蛋白水解液分析用层析纯氨基酸，各组分浓度c（氨基酸）=2.5（2.00）umol/ml。

（7）混合氨基酸标准工作液：吸取一定量的氨基酸混合标准贮备液置于50ml容量瓶中，以稀释用柠檬酸钠缓冲液定容，混匀，使各氨基酸组分浓度c（氨基酸）=100nmol/ml。

5.测定步骤：

（1）样品处理：称取50-100ml的试样（含蛋白7.5-25mg,准确至0.1mg）于20ml安瓿或30ml具玻璃塞水解管中，加6.0mol/L盐酸溶液10ml，置液氮中冷冻，然后抽真空至7Pa(小于或等于5× $10^{-2}$ mm汞柱）后封口或充氮气，塞紧，将水解管放在（110±1）℃恒温干燥箱中，水解22-24小时，冷却，混匀，开管，过滤，用移液管吸取适量的滤液，置旋转蒸发器或浓缩器中，60℃抽真空，蒸发至干，必要时，加少许水，重复蒸干1-2次，加入pH2.2稀释上机用柠檬酸钠缓冲液3-5ml,使样液中氨基酸浓度达50-250nmol/ml,摇匀，过滤后离心，取上清液上机测定。

（2）测定：用相应的混合氨基酸标准工作液按仪器说明书，调整仪器操作参数和（或）洗脱用柠檬酸钠的pH，使各氨基酸分辨率≥85%，注入制备好的试样水解液和相应的氨基酸混合标准工作液，进行分析测定。酸解液每10个单位为一组，组件插入混合氨基酸标准工作液进行校准。

6.结果计算与表示：

试样中某氨基酸质量分数计算公式如下：

w（某氨基酸）=[ $\rho$ （某氨基酸）/m]* $10^{-6}$ *D

式中： $\rho$ 为上机水解液中氨基酸的质量分数，ng/ml；

m为试样质量，mg；

D为试样稀释倍数。

以2个平行试样测定结果的算数平均值报告，保留两位小数。

7.重复性

氨基酸含量高于0.5%时，两个平行试样测定值的相对偏差不大于5%，含量低于0.5%时，不大于0.2%时，两个平行试样测定值相差不大于0.03%对于色氨酸含量低于0.2%，相对偏差不大于5%。

二、氧化-酸水解法

1.适用范围：

该方法主要适用于含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸）的准确分析测定，此法还可以测定芳香氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸）及组氨酸以外的氨基酸测定。

在以偏重亚硫酸钠做氧化终止剂时，酪氨酸被氧化，不能测准，酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸则在以氢溴酸做终止剂时被氧化，不能测准。

2.测定原理:

蛋白质水解过程中，常伴有（半）胱氨酸和蛋氨酸的损失，因此通过可用“过甲酸”氧化，使胱氨酸和蛋氨酸分别被转变成半胱磺酸和甲硫氨酸砜，这两种化合物在酸水解中是稳定的，且易于其他氨基酸分离，然后用氢溴酸或偏重亚硫酸钠终止反应，然后进行普通水解，再经离子交换色谱法分离，并以茚三酮做柱后衍生测定。

3.仪器设备：

同普通酸水解法

4.试剂与溶液：

（1）过甲酸溶液

①常规过甲酸溶液：将30%过氧化氢与88%甲酸按1+9（V+V）混合，于室温下放置1小时，然后置冰水浴中冷却30min，临用前现配。

②浓缩饲料用过甲酸溶液：将常规过甲酸溶液中按3mg/ml，加入硝酸银即可，此溶液适用于氯化钠含量小于3%的浓缩饲料。

③当溶液饲料中氯化钠含量大于3%时，氧化剂中硝酸银浓度计算公式为：

$\rho$ R=1.454*M*wN

式中： $\rho$ R为过甲酸中硝酸银浓度，mg/ml；

wN为试样中氯化钠质量分数，

m为试样质量，mg

甲酸+过氧化氢----------过甲酸+水

（2）氧化终止剂

①48%氢溴酸

②偏重亚硫酸钠溶液：33.6g偏重亚硫酸钠加水定容至100ml

（3）其他试剂与溶液普通酸水解法

5.测定步骤：

（1）样品处理，称取试样50-75mg（含蛋白质7.5-25mg）的试样2份，精确至0.001g,置于旋转蒸发器20ml浓缩瓶或浓缩关中，于冰水浴中冷却30min后，加入已冷却过的过甲酸溶液2ml，加液时需将样品全部浸湿，但不要摇动，盖好瓶塞，连同水浴一道置于0℃冰箱中，反应16h。

（2）氧化反应终止，以下步骤依使用不同的氧化终止剂而不同

①若以氢溴酸为终止剂,于各管中加人氢溴酸0.3ml,振播,放回水浴,静置30min,然后移到旋转蒸发器或浓缩器上,在60℃、低于3.3x $10^{3}$ Pa下浓缩至干。用6mol/L盐酸溶液约15ml将残渣定量转移到20mL安瓿管中,封口，置恒温烘箱中,(110士3)℃下水解22~24h。
取出安瓿管或水解管,冷却,用水将内容物定量转移至50ml容量瓶中,定容。充分混匀,过滤,取1~2ml滤液,置旋转蒸发器或浓缩器中,在低于50℃的条件下,减压蒸发至干。加少许水重复蒸干2~3次。准确加人一定体积(2~5mL)的稀释上机用柠檬酸钠缓冲液振摇,充分溶解后离心,取上清液供仪器测定用。
②若以偏重亚硫酸钠为终止剂,则于样品氧化液中加入偏重亚硫酸钠溶液0.5mL,充分摇匀后,直接加人6mol/l盐酸溶液17.5mL,置于(110士3)℃水解 22~24 h。
取出水解管,冷却,用水将内容物转移到50ml容量瓶中,用氢氧化钠溶液中和至pH约2.2,并用稀释上机用缓冲液定容,离心,取上清液供仪器测定用。

6.结果计算与表示、重复性
同普通酸水解法

三、碱水解法

1.适用范围：
该方法适合于饲料原料、配合饲料和浓缩饲料中色氨酸的测定
2.测定原理
饲料蛋白在 110℃、碱的作用下水解,水解出的色氨酸可用离子交换色谱或高效反相色谱分离测定。

3.仪器设备
(1)聚四氟乙烯衬管。

(2)其他同普通酸水解法
4.试剂与溶液
(1)4mol/L氢氧化锂溶液。称取一水合氢氧化钾167.8g,用水溶解并稀降至1000ml。使用前取适量超声或通氮气脱气。

(2)液氮。

(3)6mol/L盐酸溶液。

(4)稀释用柠檬酸缓冲溶液,PH4.3,c(Na+)=0.2 mol/L;称取柠檬酸钠14.71g、氯化钠2.92g和柠檬酸10,50g,溶于500ml水,加人硫二甘醇5.0ml和辛酸0.1ml,加水定容至1000 ml,摇匀。

(5)不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液:按氨基酸分析仪器说明书配制。
(6)茚三酮溶液:按氨基酸仪器说明书配制。

(7)L-色氨酸标准贮备液:准确称取层析纯L-色氨酸102.0mg,加少许水和数滴0.1mol/L氢氧化钠溶液,使之溶解,定量转移至100ml容量瓶中,加少许水和数滴0.1mol/L氢氧化钠溶液，使之溶解，定量转移至100ml容量瓶中，加水至刻度。c(色氨酸)=5.0umol/mL。

(8)氨基酸混合标准贮备液:含L-天门冬氨酸、L-苏氨酸等17种常规蛋白水解液分析用层析纯氨基酸,各组分浓度c(氨基酸)=2.5(或2.00)mol/ml

(9)混合氨基酸标准工作液:准确吸取2.00ml L-色氨酸标准贮备液和适量的氨基酸混合标准贮备液,置于50mL容量瓶中,用pH4.3柠檬酸钠缓冲液定容。该溶液色氨酸浓度为200nmol/ml，而其他氨基酸浓度为100nmol/mL
5.测定步骤
(1)称取50~100mg的试样(对于脂肪含量大于、等于5%的样品需先脱脂)(准确至0.0001g),置于聚四氟乙衬管中,加1.50mL碱解剂,于液氨中冷冻,而后将衬管插入水解班管,抽真空至7Pa或充氮(至少5 min),封管。然后,将水解管放入(110士1)℃水解管,冷至室温，开恒温干燥箱,水解 20h,取出水解管，冷却至室温，开管，用稀释上机用柠檬酸钠缓冲液将水解液定时地转移到10ml或用25ml容量瓶中中,加人盐酸溶液约1.00 ml中和,并用上述缓冲液定容，离心或用0.45um滤过膜过滤后,取清液贮于冰箱中待上机测定使用。
(2)测定。用相应的混合氨基酸标准工作液按仪器说明书,调整仪器操作参数注和(或)洗脱用柠檬酸钠的pH,使各氨基酸分辨率≥85%，注入制备好的试样水解液和相应的氨基酸混合标准工作液，进行分析测定，碱解液每6个单样为1组，组间插入混合氨基酸标准工作液进行校准。

6.结果计算与表示

试样中色氨酸的质量分数分别按以下公式进行计算

w1（Trp）=( $\rho$ 1/m)* $10^{-6}$ *D

w2（Trp）=( $\rho$ 2/[m(1-w(EE))]* $10^{-6}$ *D

式中：w1（Trp）为用未脱脂试样测定的色氨酸的质量分数，

w2（Trp）为用脱脂试样测定的色氨酸的质量分数；

$\rho$ 1为每毫升上机水解液中色氨酸的含量，ng/ml；

$\rho$ 2为每毫升上机液中色氨酸的含量，ng/ml；

m为试样质量，mg，

D为试样稀释倍数，

w（EE）试样中脂肪的质量分数。

7.重复性
同普通酸水解法

四、酸提取法

1.适用范围

该方法适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中添加的赖氨酸、蛋氨酸苏氨酸、色氨酸等游离氨基酸的测定。
2.测定原理：

饲料中添加的游离氨基酸以稀盐酸提取,经离子交换色谱分离、测定
3.仪器设备
同普通酸水解法
4.试剂与溶液
(1)提取剂,0.1mol/L盐酸溶液: 取8.3mL优级纯盐酸,用水定容到1 000 mL,混匀。
(2)不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸缓冲液: 按仪器说明书配制。
(3)茚三酮溶液: 按仪器说明书配制。
(4)蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸标准贮备液: 于3个100ml烧杯中,分别称取蛋氨酸 93.3 mg、赖氨酸盐酸盐114.2mg和苏氨酸74.4mg,加水约50 ml和数滴盐酸盐溶解,定量地转移至各自的250ml容量瓶中,并用水定容。该液各氨基酸浓度c(氨基酸)=2.50 umol/ml.

(5)混合氨基酸标准工作液: 分别吸取蛋氨酸,赖氨酸和苏氨酸标准贮备液各1.00mL于同一25mL容量瓶中,用水稀释至刻度。该液各氨基酸的浓度c(氨基酸)=100 nmol/mL。
5.测定步骤
(1)样品处理。称取1~2g饲料试样(蛋氨酸含量≤4 mg,赖氨酸可略高)加0.1mol/L盐酸溶液30mL,搅拌提取15 min,沉放片刻,将上清过滤到100mL容量瓶中,残渣加水25ml,搅拌3min。重复提取2次,再将上清液过滤到容量瓶中,用水冲洗提取瓶和滤纸上的残渣,并定容。摇匀,取上清液供上机测定。若试样提取过程中,过滤太慢,也可4000r/min下离心10 min。测定赖氨酸时,预混料和浓缩饲料基质会有较大干扰,应针对待测试样同时做添加回收率试验，以校准测定结果。
(2)测定。用相应的混合氨基酸标准工作液按仪器说明书,调整仪器操作参数和(或)洗脱用柠檬酸钠的pH,使各氨基酸分辨率≥85%,注入制备好的试样水解液和相应的氨基酸混合标准工作液,进行分析测定。酸提取液每6个单样为一组,组间插入混合氨基酸标准工作液进行校准。
6.结果计算与表示、重复性
同普通酸水解法。