【泰克生物】核体系酵母双杂交技术详解

核体系酵母双杂交技术（Y2H）最早由Fields和Song于1989年提出。该技术基于转录因子的模块化结构，通过在酵母细胞核内重构目标蛋白质间的相互作用来检测蛋白质间的相互作用。Y2H技术已经成为研究蛋白质相互作用、发现新的相互作用伴侣及探索信号传导途径的关键方法。

核体系酵母双杂交技术的核心在于重构转录激活因子的功能。在这个系统中，目标蛋白被分为两部分：诱饵蛋白（bait）和猎物蛋白（prey）。诱饵蛋白通常与DNA结合结构域（DNA-binding domain, BD）融合，猎物蛋白与转录激活结构域（Activation domain, AD）融合。当诱饵蛋白和猎物蛋白之间存在相互作用时，AD和BD的物理接近会启动报告基因的转录，最终通过筛选报告基因的表达来检测蛋白质间的相互作用。

酵母双杂建库与酵母双杂筛库

酵母双杂建库

酵母双杂建库是Y2H实验中的关键步骤之一。建库指的是构建一个表达猎物蛋白（prey）的cDNA文库，这个文库通常来源于感兴趣的组织或细胞类型。通过将感兴趣的cDNA与AD融合，并导入酵母细胞，可以在酵母细胞内表达这些猎物蛋白。一个高质量的酵母双杂建库应当包含目标生物体内尽可能多的转录本，以确保最大程度的覆盖和发现潜在的蛋白质相互作用。

酵母双杂筛库

在酵母双杂交实验中，酵母双杂筛库的目的是筛选出与诱饵蛋白相互作用的猎物蛋白。通过将诱饵蛋白与特定的BD融合并导入酵母细胞，与含有猎物蛋白的AD融合表达文库细胞共同孵育，能够筛选出与诱饵蛋白发生相互作用的猎物蛋白。这些筛选步骤通常伴随着抗性基因或报告基因的表达，以便于在选择性培养基上选择阳性克隆。

核体系酵母双杂交的操作流程

1. 构建诱饵表达载体：将感兴趣的诱饵蛋白编码序列与BD序列融合，克隆至适当的酵母表达载体中。

2. 酵母双杂建库：构建含有AD融合猎物蛋白的表达文库，将其转入酵母细胞中。

3. 共转化和筛选：将诱饵表达载体与猎物表达文库共转化入酵母细胞，并在选择性培养基上进行筛选。阳性克隆的出现表明诱饵和猎物蛋白之间存在相互作用。

4. 验证相互作用：通过进一步的实验，如共免疫沉淀、GST pull-down等方法，验证酵母双杂筛库筛选出的相互作用蛋白的真实性。

核体系酵母双杂交技术的应用

- 探索蛋白质相互作用网络：通过酵母双杂筛库，研究人员可以识别并验证大量蛋白质相互作用，绘制细胞内的蛋白质相互作用网络。

- 发现信号传导途径：在信号传导研究中，酵母双杂交技术被用来识别参与信号传递的关键蛋白。

- 疾病相关蛋白质研究：酵母双杂筛库已用于筛选与癌症、神经退行性疾病等人类疾病相关的蛋白质相互作用。

核体系酵母双杂交技术以其高效性和灵敏度，在蛋白质相互作用研究中占据了重要地位。通过酵母双杂建库和酵母双杂筛库的结合，研究人员能够在细胞内环境中系统地探索蛋白质的相互作用，为理解生物学过程和疾病机制提供了重要信息。

参考文献

1. Fields, S., & Song, O. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340(6230), 245-246.

2. Bartel, P. L., Chien, C. T., Sternglanz, R., & Fields, S. (1993). Using the two-hybrid system to detect protein-protein interactions. Cell, 74(1), 73-82.

3. Vojtek, A. B., & Hollenberg, S. M. (1995). Ras-Raf interaction: two-hybrid analysis. Methods in Enzymology, 255, 331-342.

4. Suter, B., & Auerbach, D. (2002). Yeast two-hybrid screening of protein-protein interactions in proteome scale. Genomics, 80(5), 559-570.

5. Ito, T., Chiba, T., Ozawa, R., Yoshida, M., Hattori, M., & Sakaki, Y. (2001). A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences, 98(8), 4569-4574.