EasyMetagenome易宏基因组——简单易用的宏基因组分析流程-来自刘永鑫团队的秘密武器

于 2024-08-21 11:59:18 发布
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文章标签： scala 开发语言 后端
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本文链接：https://blog.csdn.net/2401_85957163/article/details/141390043
版权

官方教程详见 https://github.com/DerrickWood/kraken2/blob/master/docs/MANUAL.markdown

本地构建最完整索引，自定义微生物数据库，如标准+真菌+原生动物+质粒+植物

mkdir -p ${db}/kraken2/kraken2_self
conda activate kraken2
# 显示帮助
kraken2-build -h
# 下载物种注释
kraken2-build --download-taxonomy --threads 24 --db ${db}/kraken2/kraken2_self
# 下载数据库，需要12-24小时
for i in archaea bacteria UniVec_Core viral human fungi plasmid protozoa plant; do
    kraken2-build --download-library $i --threads 24 --db ${db}/kraken2/kraken2_self
done
# 确定的库建索引，4p,4h
time kraken2-build --build --threads 48 --db ${db}/kraken2/kraken2_self
# bracken索引，长度推荐100/150, 24p, 1h;
time bracken-build -d ./ -t 24 -k 35 -l 100
time bracken-build -d ./ -t 24 -k 35 -l 150

Perl版本不对

常见问题：Perl版本不对，人工指定perl版本如下

PERL5LIB=~/miniconda3/envs/kraken2/lib/site_perl/5.26.2/x86_64-linux-thread-multi:~/miniconda3/envs/kraken2/lib/site_perl/5.26.2:~/miniconda3/envs/kraken2/lib/5.26.2/x86_64-linux-thread-multi:~/miniconda3/envs/kraken2/lib/5.26.2

salmon手动安装和使用

# 如不可用，尝试下载二进制和添加环境变量
wget https://github.com/COMBINE-lab/salmon/releases/download/v0.14.0/salmon-0.14.0_linux_x86_64.tar.gz
tar xvzf salmon-0.14.0_linux_x86_64.tar.gz 
cp -rf salmon-latest_linux_x86_64/ ${soft}/envs/metagenome_env/share/salmon
# 或者直接使用软件全路径
${soft}/envs/metagenome_env/share/salmon/bin/salmon -v # 0.14.0

MetaWRAP分箱

shorten_contig_names.py报错

更新 ${soft}/envs/metawrap/bin/metawrap-scripts/shorten_contig_names.py 脚本

#!/usr/bin/env python2.7
import sys
shorten=False
for line in open(sys.argv[1]):
    if line[0]!=">":
        print line.rstrip()
    else:
        if shorten==True:
            #print "_".join(line.rstrip().split("_")[:4])
            lineL = line.rstrip().split("_")
            new_line = '_'.join([lineL[0], lineL[1], lineL[3]])
            print new_line[:20]
        elif len(line)>20 and len(line.split("_"))>5:
            lineL = line.rstrip().split("_")
            new_line = '_'.join([lineL[0], lineL[1], lineL[3]])
            #print "_".join(line.rstrip().split("_")[:4])
            print new_line[:20]
            shorten=True
        else:
            print line.rstrip()

绘图plot_binning_results.py报错

更新 ${soft}/envs/metawrap/bin/metawrap-scripts/plot_binning_results.py 脚本

# 原脚本存在嵌套错误，会输出报错，修改部分如下
# Traceback (most recent call last):
#  File "/anaconda3/envs/metawrap-env/bin/metawrap-scripts/plot_binning_results.py", line 119, in <module>
#   plt.text(x_pos, y_pos, bin_set, fontsize=18, color=c)
# NameError: name 'x_pos' is not defined

    # add bin set label to plot
    for x_pos,y in enumerate(data[bin_set]):
            if y>y_pos:
                    break
            plt.text(x_pos, y_pos, bin_set, fontsize=18, color=c)
            y_pos+=y_increment
            
# add plot and axis titles and adjust the edges
plt.title("Bin contamination ranking", fontsize=26)
plt.xlabel("Acending contamination rank", fontsize=16)
plt.ylabel("Estimated bin contamination (log scale)", fontsize=16)
plt.gcf().subplots_adjust(right=0.9)

# save figure
print "Saving figures binning_results.eps and binning_results.png ..."
plt.tight_layout(w_pad=10)
plt.subplots_adjust(top=0.92, right=0.90, left=0.08)
plt.savefig("binning_results.png",format='png', dpi=300)
plt.savefig("binning_results.eps",format='eps')
#plt.show()
EOF

blast版本不兼容

更新 metawrap 中的 blast 版本，直接到https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/，下载最新版本blastn，再到conda的metawrap环境bin目录下，替换掉旧版本的blastn

# 如果出现这个错误，BLAST Database error: Error: Not a valid version 4 database.
# 是metawrap 中 blast 版本太老了，需要更新下
wget -c https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ncbi-blast-2.13.0+-x64-linux.tar.gz
tar xvzf ncbi-blast-2.13.0+-x64-linux.tar.gz
mv ncbi-blast-2.13.0+/bin/* ${soft}/envs/metawrap-env/bin/

附录

Conda安装小工具

以下小工具已经整合至EasyMicrobiome项目中的linux文件夹，以下代码提供学习多种自主安装的参考方法，用于积累conda使用

并行计算管理rush/paprllel

# conda安装rush，无依赖关系更好用的并行工具
conda install rush -c bioconda
# Ubuntu下安装方法 apt install parallel
# conda安装parallel，版本有点老
conda install parallel -c bioconda
parallel --version # GNU parallel 20170422

表格统计工具csvtk和序列处理seqkit(可选中)

# 方法1. conda安装，可能有点旧
conda install csvtk -c bioconda
conda install seqkit -c bioconda

# 方法2. 直接下载最新版 https://github.com/shenwei356，如以csvtk为例手动安装
wget -c https://github.com/shenwei356/csvtk/releases/download/v0.22.0/csvtk_linux_amd64.tar.gz
tar xvzf csvtk_linux_amd64.tar.gz
cp csvtk ~/miniconda3/bin/

宿主参考基因组下载

  • EnsembleGenomes http://ensemblgenomes.org/
  • 包括动物、植物、原生生物、真菌、细菌等，此外植物还 Phytozome https://phytozome-next.jgi.doe.gov/ ，以及单个物种和专用数据库

以Ensemble中拟南芥为例：Arabidopsis thaliana – Genome assembly – Download DNA sequence (无反应)，点TAIR链接跳转ENA，下载All Seq FASTA

wget https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/api/fasta/GCA_000001735.1?download=true&gzip=true
mv GCA_000001735.1?download=true TAIR10.fa

以Ensemble中水稻为例：Oryza sativa Japonica —— IRGSP-1.0

wget https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/api/fasta/GCA_001433935.1?download=true&gzip=true
mv GCA_001433935.1?download=true IRGSP1.0.fa

KEGG层级注释整理

己整合至EasyMicrobiome中，自己更新请访问 https://www.kegg.jp/kegg-bin/show_brite?ko00001.keg 下载htext

# 转换ABCD为列表
kegg_ko00001_htext2tsv.pl -i ko00001.keg -o ko00001.tsv
# 统计行数，2021.1月版55761行，整理后为55103个条目
wc -l ko00001.*
# 统计各级数量, /54/527/23917
for i in `seq 1 2 8`;do
    cut -f ${i} ko00001.tsv|sort|uniq|wc -l ; done
# 生成KO编号和注释列表
cut -f 7,8 ko00001.tsv|sort|uniq|sed '1 i KO\tDescription' \
  > KO_description.txt
# KO与通路(Pathway)对应表，用于合并D级为C级
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} {print $7,$6}' ko00001.tsv | sed '1 i KO\tpathway' \
  > KO_path.list

毒力因子数据库VFDB

官网：http://www.mgc.ac.cn/VFs/ 数据每周更新

mkdir -p ${db}/vfdb && cd ${db}/vfdb
# 毒力因子描述文件
wget -c http://www.mgc.ac.cn/VFs/Down/VFs.xls.gz
# 核心数据库(1117K)
wget -c http://www.mgc.ac.cn/VFs/Down/VFDB_setA_pro.fas.gz
# 完整数据库(4.99M)
wget -c http://www.mgc.ac.cn/VFs/Down/VFDB_setB_pro.fas.gz
# 解压
gunzip *.gz

宏基因组基于读长的分析 HUMAnN2/Metaphlan2/graphlan

HUMAnN2解包安装

# 下载
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/humann2.tar.gz
# 指定安装目录
mkdir -p ${soft}/envs/humann2
tar -xvzf humann2.tar.gz -C ${soft}/envs/humann2
# 启动环境
conda activate humann2
# 初始化环境
conda unpack

HUMAnN2直接安装

# mamba 是快速版本的 conda
mamba create -n humann2 humann2 graphlan export2graphlan -c bioconda -y

HUMAnN2安装测试

conda activate humann2
# 记录核心软件版本
humann2 --version # v2.8.1
metaphlan2.py -v # 2.7.5 (6 February 2018)
diamond help | head -n 1 #  v0.8.36.98
graphlan.py --version # 1.1.3 (5 June 2018)
export2graphlan.py -h # 0.22 of 05 May

# 测试流程是否可用
humann2_test

HUMAnN2物种和功能数据库

# 显示可用分类、泛基因组和功能数据库
humann2_databases

# 安装数据库(注：数据库下载慢或失败，附录有国内备份链接)
cd ${db}
mkdir -p ${db}/humann2 # 建立下载目录
# 输助比对数据库 593MB
humann2_databases --download utility_mapping full ${db}/humann2
# 微生物泛基因组 5.37 GB
humann2_databases --download chocophlan full ${db}/humann2
# 功能基因diamond索引 10.3 GB
humann2_databases --download uniref uniref90_diamond ${db}/humann2

# humann2数据库无法下载：附录备用链接下载后手动配置
mkdir -p ${db}/humann2/chocophlan && cd ${db}/humann2/chocophlan
tar xvzf full_chocophlan_plus_viral.v0.1.1.tar.gz
mkdir -p ${db}/humann2/uniref && cd ${db}/humann2/uniref
tar xvzf uniref90_annotated_1_1.tar.gz
mkdir -p ${db}/humann2/utility_mapping && cd ${db}/humann2/utility_mapping
tar xvzf full_mapping_1_1.tar.gz

# 设置数据库位置
# 显示参数
humann2_config --print
# 如修改线程数，推荐3-8，根据实际情况调整
humann2_config --update run_modes threads 4
humann2_config --update database_folders utility_mapping ${db}/humann2/utility_mapping
humann2_config --update database_folders nucleotide ${db}/humann2/chocophlan
humann2_config --update database_folders protein ${db}/humann2/uniref
humann2_config --print

## metaphlan2数据库下载和配置
mkdir -p ${db}/humann2 && cd ${db}/humann2
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/humann2/metaphlan2.tar.gz
tar xvzf metaphlan2.tar.gz
# 链接到软件安装目录
mkdir -p ${soft}/envs/humann2/bin/databases
ln -s ${db}/humann2/metaphlan2/* ${soft}/envs/humann2/bin/databases/

n=kneaddata
conda pack -f --ignore-missing-files -n ${n} -o ${n}.tar.gz

2、序列处理分析流程

易宏基因组流程 EasyMetagenome Pipeline

# 版本Version: 1.20, 2023/11/23
    # 操作系统Operation System: Linux Ubuntu 22.04+ / CentOS 7.7+

一、数据预处理 Data preprocessing

1.1 准备工作 Preparing
  1. 首次使用请参照0Install.sh脚本，安装软件和数据库(大约1-3天，仅一次)
  2. 易宏基因组(EasyMetagenome)流程1Pipeline.sh复制到项目文件夹，如本次为meta
  3. 项目文件夹准备测序数据(seq/*.fq.gz)和样本元数据(result/metadata.txt)

**环境变量设置 Environment variable settings**
**分析前必须运行，设置数据库、软件和工作目录**

# Conda软件安装目录，`conda env list`查看，如/anaconda3
soft=~/miniconda3
# 数据库database(db)位置，如管理员/db，个人~/db
db=~/db
# 设置工作目录work directory(wd)，如meta
wd=~/meta
# 创建并进入工作目录
mkdir -p $wd && cd $wd
# 创建3个常用子目录：序列，临时文件和结果
mkdir -p seq temp result
# 添加分析所需的软件、脚本至环境变量，添加至~/.bashrc中自动加载
PATH=$soft/bin:$soft/condabin:/usr/local/sbin:/usr/local/bin:/usr/sbin:/usr/bin:/sbin:/bin:$db/EasyMicrobiome/linux:$db/EasyMicrobiome/script
echo $PATH

**元数据和序列文件 Metadata and Sequence Files**

元数据

# 上传元数据metadata.txt至result目录，此处下载并重命名
wget http://www.imeta.science/github/EasyMetagenome/result/metadata.txt
mv metadata.txt result/metadata.txt
# 检查文件格式，^I为制表符，$为Linux换行，^M$为Windows回车，^M为Mac换行符
cat -A result/metadata.txt

# 根据样本文件生成元数据，可筛选子集，如EB开头
ls seq/EB*|grep '_1'|cut -f1 -d '_'|cut -f 2 -d '/'|sed'1 i SampleID'>result/metadataEB.txt
cp result/metadataEB.txt result/metadata.txt

# 元数据细节优化
# 转换Windows回车为Linux换行
sed -i 's/\r//' result/metadata.txt
# 去除数据中的一个多余空格
sed -i 's/Male  /Male/' result/metadata.txt
cat -A result/metadata.txt

序列文件

# 用户使用filezilla上传测序文件至seq目录，本次从网络下载
# seq 目录下已经有测试文件，下载跳过
cd seq/
awk '{system("wget -c http://www.imeta.science/github/EasyMetagenome/seq/"$1"_1.fq.gz")}' <(tail -n+2 ../result/metadata.txt)
awk '{system("wget -c http://www.imeta.science/github/EasyMetagenome/seq/"$1"_2.fq.gz")}' <(tail -n+2 ../result/metadata.txt)
cd ..
# ls查看文件大小，-l 列出详细信息 (l: list)，-sh 显示人类可读方式文件大小 (s: size; h: human readable)
ls -lsh seq/*.fq.gz

序列文件格式检查 
zless/zcat查看可压缩文件，检查序列质量格式(质量值大写字母为标准Phred33格式，小写字母为Phred64，需参考附录：质量值转换)；检查双端序列ID是否重名，如重名需要改名。参考**附录 —— 质控kneaddata，去宿主后双端不匹配；序列改名**。

# 设置某个样本名为变量i，以后再无需修改
i=C1
# zless查看压缩文件，空格翻页，q退出; head指定显示行数
zless seq/${i}_1.fq.gz | head -n4

**工作目录和文件结构总结**

# ├── pipeline.sh
# ├── result
# │   └── metadata.txt
# ├── seq
# │   ├── C1_1.fq.gz
# │   ├── ...
# │   └── N1_2.fq.gz
# └── temp

*   1pipeline.sh是分析流程代码；
*   seq目录中有2个样本Illumina双端测序，4个序列文件；
*   temp是临时文件夹，存储分析中间文件，结束可全部删除节约空间
*   result是重要节点文件和整理化的分析结果图表，
*   实验设计metadata.txt也在此

1.2 Fastp质量控制 Quality Control
# 创建目录，记录软件版本和引文
mkdir -p temp/qc result/qc
fastp

# 单样本质控
i=C1
fastp -i seq/${i}_1.fq.gz  -I seq/${i}_2.fq.gz \
  -o temp/qc/${i}_1.fastq -O temp/qc/${i}_2.fastq

# 多样本并行
# -j 2: 表示同时处理2个样本
time tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j 2 \
  "fastp -i seq/{1}_1.fq.gz -I seq/{1}_2.fq.gz \
    -j temp/qc/{1}_fastp.json -h temp/qc/{1}_fastp.html \
    -o temp/qc/{1}_1.fastq  -O temp/qc/{1}_2.fastq \
    > temp/qc/{1}.log 2>&1 "

# 质控后结果汇总
echo -e "SampleID\tRaw\tClean" > temp/fastp
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
    echo -e -n "$i\t" >> temp/fastp
    grep 'total reads' temp/qc/${i}.log|uniq|cut -f2 -d ':'|tr '\n' '\t' >> temp/fastp
    echo "" >> temp/fastp
done
sed -i 's/ //g;s/\t$//' temp/fastp
# 按metadata排序
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"}NR==FNR{a[$1]=$0}NR>FNR{print a[$1]}' temp/fastp result/metadata.txt \
  > result/qc/fastp.txt
cat result/qc/fastp.txt
1.3 KneadData去宿主 Host removal

kneaddata是流程主要依赖bowtie2比对宿主，然后筛选非宿主序列用于下游分析。

# 创建目录、启动环境、记录版本
mkdir -p temp/hr
conda activate kneaddata
kneaddata --version # 0.12.0

多样品并行去宿主，16p 4h

time tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j 2 \
  "sed '1~4 s/ 1:/.1:/;1~4 s/$/\/1/' temp/qc/{}_1.fastq > /tmp/{}_1.fastq; \
  sed '1~4 s/ 2:/.1:/;1~4 s/$/\/2/' temp/qc/{}_2.fastq > /tmp/{}_2.fastq; \
  kneaddata -i1 /tmp/{1}_1.fastq -i2 /tmp/{1}_2.fastq \
  -o temp/hr --output-prefix {1} \
  --bypass-trim --bypass-trf --reorder \
  --bowtie2-options '--very-sensitive --dovetail' \
  -db ${db}/kneaddata/human/hg37dec_v0.1 \
  --remove-intermediate-output -v -t 3; \
  rm /tmp/{}_1.fastq /tmp/{}_2.fastq"

# *  匹配任意多个字符，？ 匹配任意一个字符
ls -shtr temp/hr/*_paired_?.fastq

简化改名

# Ubuntu系统改名
rename 's/paired_//' temp/hr/*.fastq
# CentOS系统改名
rename 'paired_' '' temp/hr/*.fastq

大文件清理，高宿主含量样本可节约>90%空间

# 使用命令的绝对路径确保使用无参数的命令，管理员用alias自定义命令含参数，影响操作结果
/bin/rm -rf temp/hr/*contam* temp/hr/*unmatched* temp/hr/reformatted* temp/hr/_temp*
ls -l temp/hr/

质控结果汇总

kneaddata_read_count_table --input temp/hr \
  --output temp/kneaddata.txt
# 筛选重点结果列
cut -f 1,2,5,6 temp/kneaddata.txt | sed 's/_1_kneaddata//' > result/qc/sum.txt
# 对齐方式查看表格
csvtk -t pretty result/qc/sum.txt

二、基于读长分析 Read-based (HUMAnN3+MetaPhlAn4+Kraken2)

2.1 准备HUMAnN输入文件

HUMAnN要求双端序列合并的文件作为输入，for循环根据实验设计样本名批量双端序列合并。注意星号(\*)和问号(?)，分别代表多个和单个字符。当然大家更不能溜号，行分割的代码行末有一个\

mkdir -p temp/concat
# 双端合并为单个文件
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do 
  cat temp/hr/${i}_?.fastq \
  > temp/concat/${i}.fq; done
# 查看样品数量和大小
ls -shl temp/concat/*.fq
# 数据太大，计算时间长，可用head对单端分析截取20M序列，即3G，行数为80M行，详见附录：HUMAnN2减少输入文件加速
2.2 HUMAnN计算物种和功能组成

*   物种组成调用MetaPhlAn4
*   输入文件：temp/concat/*.fq 每个样品质控后双端合并后的fastq序列
*   输出文件：temp/humann3/ 目录下
*   C1_pathabundance.tsv
*   C1_pathcoverage.tsv
*   C1_genefamilies.tsv
*   整合后的输出：
*   result/metaphlan4/taxonomy.tsv 物种丰度表
*   result/metaphlan4/taxonomy.spf 物种丰度表（用于stamp分析）
*   result/humann3/pathabundance_relab_unstratified.tsv 通路丰度表
*   result/humann3/pathabundance_relab_stratified.tsv 通路物种组成丰度表
*   stratified(每个菌对此功能通路组成的贡献)和unstratified(功能组成)

启动humann3环境，检查数据库配置

conda activate humann3
# 备选source加载指定环境
# source ~/miniconda3/envs/humann3/bin/activate
mkdir -p temp/humann3
humann --version # v3.7
humann_config

单样本1.25M PE150运行测试，8p，2.5M，1~2h；0.2M, 34m；0.1M，30m；0.01M，25m；16p，18m

i=C1

3p,26m; 数据库使用ssd缩短到19m；16p,8m

time humann --input temp/concat/${i}.fq --output temp/humann3 --threads 3 --metaphlan-options '--bowtie2db /db/metaphlan4 --index mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212 --offline'

多样本并行计算，测试数据约30m，推荐16p，3小时/样本

# 如果服务器性能好，请设置--threads值为8/16/32
tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1 | rush -j 2 \
  "humann --input temp/concat/{1}.fq  \
  --output temp/humann3/ --threads 3 --metaphlan-options '--bowtie2db /db/metaphlan4 --index mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212 --offline'"

# 移动重要文件至humann3目录
# $(cmd) 与 `cmd` 通常是等价的；`cmd`写法更简单，但要注意反引号是键盘左上角ESC下面的按键，$(cmd)更通用，适合嵌套使用
for i in $(tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1); do  
   mv temp/humann3/${i}_humann_temp/${i}_metaphlan_bugs_list.tsv temp/humann3/
done
# 删除临时文件，极占用空间
/bin/rm -rf temp/concat/* temp/humann3/*_humann_temp

(可选)单独运行MetaPhlAn4

mkdir -p temp/humann3
i=C1
# 仅物种注释极快4p, 2m, 1m读取数据库
time metaphlan --input_type fastq temp/qc/${i}_1.fastq \
  temp/humann3/${i}.txt --bowtie2db /db/metaphlan4 --index mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212 --offline \
  --nproc 4
2.3 物种组成表

**样品结果合并**

mkdir -p result/metaphlan4
# 合并、修正样本名、预览
merge_metaphlan_tables.py temp/humann3/*_metaphlan_bugs_list.tsv | \
  sed 's/_metaphlan_bugs_list//g' | tail -n+2 | sed '1 s/clade_name/ID/' | sed '2i #metaphlan4'> result/metaphlan4/taxonomy.tsv
csvtk -t stat result/metaphlan4/taxonomy.tsv
head -n5 result/metaphlan4/taxonomy.tsv

**转换为stamp的spf格式**

# metaphlan4较2增加更多unclassified和重复结果，用sort和uniq去除
metaphlan_to_stamp.pl result/metaphlan4/taxonomy.tsv \
  |sort -r | uniq > result/metaphlan4/taxonomy.spf
head result/metaphlan4/taxonomy.spf
# STAMP不支持unclassified，需要过滤掉再使用
grep -v 'unclassified' result/metaphlan4/taxonomy.spf > result/metaphlan4/taxonomy2.spf
# 下载metadata.txt和taxonomy2.spf使用stamp分析
2.4 功能组成分析

功能组成样本合并合并

mkdir -p result/humann3
humann_join_tables --input temp/humann3 \
  --file_name pathabundance \
  --output result/humann3/pathabundance.tsv
# 样本名调整：删除列名多余信息
sed -i 's/_Abundance//g' result/humann3/pathabundance.tsv
# 统计和预览
csvtk -t stat result/humann3/pathabundance.tsv
head -n5 result/humann3/pathabundance.tsv

标准化为相对丰度relab(1)或百万比cpm(1,000,000)

humann_renorm_table \
  --input result/humann3/pathabundance.tsv \
  --units relab \
  --output result/humann3/pathabundance_relab.tsv
head -n5 result/humann3/pathabundance_relab.tsv

分层结果：功能和对应物种表(stratified)和功能组成表(unstratified)

humann_split_stratified_table \
  --input result/humann3/pathabundance_relab.tsv \
  --output result/humann3/ 

差异比较和柱状图

两样本无法组间比较，在pcl层面替换为HMP数据进行统计和可视化。

*   输入数据：通路丰度表格 result/humann3/pathabundance.tsv和实验设计 result/metadata.txt
*   中间数据：包含分组信息的通路丰度表格文件 result/humann3/pathabundance.pcl
*   输出结果：result/humann3/associate.txt

在通路丰度中添加分组

## 提取样品列表
head -n1 result/humann3/pathabundance.tsv | sed 's/# Pathway/SampleID/' | tr '\t' '\n' > temp/header
## 对应分组，本示例分组为第2列($2)，根据实际情况修改
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"}NR==FNR{a[$1]=$2}NR>FNR{print a[$1]}' result/metadata.txt temp/header | tr '\n' '\t'|sed 's/\t$/\n/' > temp/group
# 合成样本、分组+数据
cat <(head -n1 result/humann3/pathabundance.tsv) temp/group <(tail -n+2 result/humann3/pathabundance.tsv) \
  > result/humann3/pathabundance.pcl
head -n5 result/humann3/pathabundance.pcl
tail -n5 result/humann3/pathabundance.pcl

组间比较，样本量少无差异，结果为4列的文件：通路名字，通路在各个分组的丰度，差异P-value，校正后的Q-value。
演示数据2样本无法统计，此处替换为HMP的结果演示统计和绘图(上传hmp\_pathabund.pcl，替换pathabundance.pcl为hmp\_pathabund.pcl)。

wget -c http://www.imeta.science/github/EasyMetagenome/result/humann2/hmp_pathabund.pcl
/bin/cp -f hmp_pathabund.pcl result/humann3/
# 设置输入文件名
pcl=result/humann3/hmp_pathabund.pcl
# 统计表格行、列数量
csvtk -t stat ${pcl}
head -n3 ${pcl} | cut -f 1-5
# 按分组KW检验，注意第二列的分组列名
humann_associate --input ${pcl} \
    --focal-metadatum Group --focal-type categorical \
    --last-metadatum Group --fdr 0.05 \
    --output result/humann3/associate.txt
wc -l result/humann3/associate.txt
head -n5 result/humann3/associate.txt

barplot展示通路的物种组成，如：腺苷核苷酸合成

# 指定差异通路，如 P163-PWY，--sort sum metadata 按丰度和分组排序
path=P163-PWY
humann_barplot \
    --input ${pcl} --focal-feature ${path} \
    --focal-metadata Group --last-metadata Group \
    --output result/humann3/barplot_${path}.pdf --sort sum metadata 

KEGG注释

支持GO、PFAM、eggNOG、level4ec、KEGG的D级KO等注释，详见humann\_regroup\_table -h。

# 转换基因家族为KO(uniref90_ko)，可选eggNOG(uniref90_eggnog)或酶(uniref90_level4ec)
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
  humann_regroup_table \
    -i temp/humann3/${i}_genefamilies.tsv \
    -g uniref90_ko \
    -o temp/humann3/${i}_ko.tsv
done
# 合并，并修正样本名
humann_join_tables \
  --input temp/humann3/ \
  --file_name ko \
  --output result/humann3/ko.tsv
sed -i '1s/_Abundance-RPKs//g' result/humann3/ko.tsv
tail result/humann3/ko.tsv
# 与pathabundance类似，可进行标准化renorm、分层stratified、柱状图barplot等操作

# 分层结果：功能和对应物种表(stratified)和功能组成表(unstratified)
humann_split_stratified_table \
  --input result/humann3/ko.tsv \
  --output result/humann3/ 
wc -l result/humann3/ko*

# KO合并为高层次L2, L1通路代码KO to level 1/2/3
summarizeAbundance.py \
  -i result/humann3/ko_unstratified.tsv \
  -m ${db}/EasyMicrobiome/kegg/KO1-4.txt \
  -c 2,3,4 -s ',+,+,' -n raw \
  -o result/humann3/KEGG
wc -l result/humann3/KEGG*
2.5 GraPhlAn图

metaphlan2 to graphlan

conda activate humann2
export2graphlan.py --skip_rows 1,2 -i result/metaphlan4/taxonomy.tsv \
  --tree temp/merged_abundance.tree.txt \
  --annotation temp/merged_abundance.annot.txt \
  --most_abundant 1000 --abundance_threshold 20 --least_biomarkers 10 \
  --annotations 3,4 --external_annotations 7
# 参数说明见PPT，或运行 export2graphlan.py --help
# graphlan annotation
graphlan_annotate.py --annot temp/merged_abundance.annot.txt \
  temp/merged_abundance.tree.txt  temp/merged_abundance.xml
# output PDF figure, annoat and legend
graphlan.py temp/merged_abundance.xml result/metaphlan4/graphlan.pdf \
  --external_legends 
# GraPhlAn Plot(测试中)
graphlan_plot.r --input result/metaphlan4/taxonomy.spf \
  --design result/metadata.txt --number 100 \
  --group all --type heatmap \
  --output result/metaphlan4/heatmap
2.6 LEfSe差异分析物种

*   输入文件：物种丰度表result/metaphlan2/taxonomy.tsv
*   输入文件：样品分组信息 result/metadata.txt
*   中间文件：整合后用于LefSe分析的文件 result/metaphlan2/lefse.txt，这个文件可以提供给www.ehbio.com/ImageGP 用于在线LefSE分析
*   LefSe结果输出：result/metaphlan2/目录下lefse开头和feature开头的文件

前面演示数据仅有2个样本，无法进行差异比较。下面使用result12目录中由12个样本生成的结果表进行演示

# 设置结果目录，自己的数据使用result，演示用result12
result=result12
# 如果没有，请下载演示数据
wget -c http://www.imeta.science/db/EasyMetagenome/result12.zip
unzip result12.zip

准备输入文件，修改样本品为组名(可手动修改)

# 提取样本行替换为每个样本一行，修改ID为SampleID
head -n1 $result/metaphlan2/taxonomy.tsv|tr '\t' '\n'|sed '1 s/ID/SampleID/' >temp/sampleid
head -n3 temp/sampleid
# 提取SampleID对应的分组Group(假设为metadata.txt中第二列$2)，替换换行\n为制表符\t，再把行末制表符\t替换回换行
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}NR==FNR{a[$1]=$2}NR>FNR{print a[$1]}' $result/metadata.txt temp/sampleid|tr '\n' '\t'|sed 's/\t$/\n/' >groupid
cat groupid
# 合并分组和数据(替换表头)
cat groupid <(tail -n+2 $result/metaphlan2/taxonomy.tsv) > $result/metaphlan2/lefse.txt
head -n3 $result/metaphlan2/lefse.txt

方法1. 推荐在线 https://www.bic.ac.cn/ImageGP/ 中LEfSe一键分析

方法2. LEfSe命令行分析

conda activate lefse
result=result12
# 格式转换为lefse内部格式
lefse-format_input.py $result/metaphlan2/lefse.txt \
  temp/input.in -c 1 -o 1000000
# 运行lefse(样本必须有重复和分组)
run_lefse.py temp/input.in temp/input.res

# 绘制物种树注释差异
lefse-plot_cladogram.py temp/input.res \
  $result/metaphlan2/lefse_cladogram.pdf --format pdf

# 绘制所有差异features柱状图
lefse-plot_res.py temp/input.res \
  $result/metaphlan2/lefse_res.pdf --format pdf
    
# 绘制单个features柱状图
# 查看显著差异features，按丰度排序
grep -v '-' temp/input.res | sort -k3,3n 
# 手动选择指定feature绘图，如Firmicutes
lefse-plot_features.py -f one --format pdf \
  --feature_name "k__Bacteria.p__Firmicutes" \
  temp/input.in temp/input.res \
  $result/metaphlan2/lefse_Firmicutes.pdf

# 批量绘制所有差异features柱状图
lefse-plot_features.py -f diff \
  --archive none --format pdf \
  temp/input.in temp/input.res \
  $result/metaphlan2/lefse_
2.7 Kraken2+Bracken物种注释和丰度估计

Kraken2可以快速完成读长(read)层面的物种注释和定量，还可以进行重叠群(contig)、基因(gene)、宏基因组组装基因组(MAG/bin)层面的序列物种注释。

# 启动kraken2工作环境
conda activate kraken2
# 记录软件版本
kraken2 --version # 2.1.2
mkdir -p temp/kraken2

Kraken2物种注释

输入：temp/qc/{1}_?.fastq 质控后的数据，{1}代表样本名；
参考数据库：-db ${db}/kraken2/pluspfp16g/
输出结果：每个样本单独输出，temp/kraken2/中的{1}_report和{1}_output
整合物种丰度表输出结果：result/kraken2/taxonomy_count.txt

(可选) 单样本注释，5m，50G大数据库较5G库注释比例提高10~20%。以C1为例，在2023/3/14版中，8g: 31.75%; 16g: 52.35%; 150g: 71.98%；同为16g，2023/10/9版本为63.88%

# 根据电脑内存由小到大选择下面3个数据库
# pluspf16g/pluspfp(55G)/plusppfp(120G)
i=C1
time kraken2 --db ${db}/kraken2/pluspf16g/ \
  --paired temp/qc/${i}_?.fastq \
  --threads 2 --use-names --report-zero-counts \
  --report temp/kraken2/${i}.report \
  --output temp/kraken2/${i}.output

多样本并行生成report，1样本8线程逐个运行，内存大但速度快，不建议用多任务并行

for i in `tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1`;do
  kraken2 --db ${db}/kraken2/pluspf16g \
  --paired temp/qc/${i}_?.fastq \
  --threads 2 --use-names --report-zero-counts \
  --report temp/kraken2/${i}.report \
  --output temp/kraken2/${i}.output; done

使用krakentools转换report为mpa格式

for i in `tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1`;do
  kreport2mpa.py -r temp/kraken2/${i}.report \
    --display-header -o temp/kraken2/${i}.mpa; done

合并样本为表格

mkdir -p result/kraken2
# 输出结果行数相同，但不一定顺序一致，要重新排序
tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1 | rush -j 1 \
  'tail -n+2 temp/kraken2/{1}.mpa | LC_ALL=C sort | cut -f 2 | sed "1 s/^/{1}\n/" > temp/kraken2/{1}_count '
# 提取第一样本品行名为表行名
header=`tail -n 1 result/metadata.txt | cut -f 1`
echo $header
tail -n+2 temp/kraken2/${header}.mpa | LC_ALL=C sort | cut -f 1 | \
  sed "1 s/^/Taxonomy\n/" > temp/kraken2/0header_count
head -n3 temp/kraken2/0header_count
# paste合并样本为表格
ls temp/kraken2/*count
paste temp/kraken2/*count > result/kraken2/tax_count.mpa
# 检查表格及统计
csvtk -t stat result/kraken2/tax_count.mpa
head -n 5 result/kraken2/tax_count.mpa

Bracken丰度估计

参数简介：

*   -d为数据库，-i为输入kraken2报告文件
*   r是读长，此处为100，通常为150，o输出重新估计的值
*   l为分类级，可选域D、门P、纲C、目O、科F、属G、种S级别丰度估计
*   t是阈值，默认为0，越大越可靠，但可用数据越少

循环重新估计每个样品的丰度，请修改tax分别重新计算P和S各1次

# 设置估算的分类级别D,P,C,O,F,G,S，常用门P和种S
# 测序6G起样本-t 10过滤低丰度物种
tax=S
mkdir -p temp/bracken
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1`;do
    # i=C1
    bracken -d ${db}/kraken2/pluspf16g/ \
      -i temp/kraken2/${i}.report \
      -r 100 -l ${tax} -t 0 \
      -o temp/bracken/${i}.brk \
      -w temp/bracken/${i}.report; done
# bracken结果合并成表: 需按表头排序，提取第6列reads count，并添加样本名
tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1 | rush -j 1 \
  'tail -n+2 temp/bracken/{1}.brk | LC_ALL=C sort | cut -f6 | sed "1 s/^/{1}\n/" \
  > temp/bracken/{1}.count'
# 提取第一样本品行名为表行名
h=`tail -n1 result/metadata.txt|cut -f1`
tail -n+2 temp/bracken/${h}.brk | sort | cut -f1 | \
  sed "1 s/^/Taxonomy\n/" > temp/bracken/0header.count
# 检查文件数，为n+1
ls temp/bracken/*count | wc
# paste合并样本为表格，并删除非零行
paste temp/bracken/*count > result/kraken2/bracken.${tax}.txt
# 统计行列，默认去除表头
csvtk -t stat result/kraken2/bracken.${tax}.txt
# 按频率过滤，-r可标准化，-e过滤(microbiome_helper)
Rscript ${db}/EasyMicrobiome/script/filter_feature_table.R \
  -i result/kraken2/bracken.${tax}.txt \
  -p 0.01 \
  -o result/kraken2/bracken.${tax}.0.01
csvtk -t stat result/kraken2/bracken.${tax}.0.01

个性化结果筛选

# 门水平去除脊索动物(人)
grep 'Chordata' result/kraken2/bracken.P.0.01
grep -v 'Chordata' result/kraken2/bracken.P.0.01 > result/kraken2/bracken.P.0.01-H

# 按物种名手动去除宿主污染，以人为例(需按种水平计算相关结果)
# 种水平去除人类P:Chordata,S:Homo sapiens
grep 'Homo sapiens' result/kraken2/bracken.S.0.01
grep -v 'Homo sapiens' result/kraken2/bracken.S.0.01 \
  > result/kraken2/bracken.S.0.01-H

分析后清理每条序列的注释大文件

/bin/rm -rf temp/kraken2/*.output

多样性和可视化alpha多样性计算：Berger Parker’s (BP), Simpson’s (Si), inverse Simpson’s (ISi), Shannon’s (Sh)

# Fisher’s (F)依赖scipy.optimize包，默认未安装

mkdir -p result/kraken2
echo -e "SampleID\tBerger Parker\tSimpson\tinverse Simpson\tShannon" > result/kraken2/alpha.txt
for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
    echo -e -n "$i\t" >> result/kraken2/alpha.txt
    for a in BP Si ISi Sh;do
        alpha_diversity.py -f temp/bracken/${i}.brk -a $a | cut -f 2 -d ':' | tr '\n' '\t' >> result/kraken2/alpha.txt
    done
    echo "" >> result/kraken2/alpha.txt
done
cat result/kraken2/alpha.txt

beta多样性计算

beta_diversity.py -i temp/bracken/*.brk --type bracken \
  > result/kraken2/beta.txt
cat result/kraken2/beta.txt

Krona图

for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
    kreport2krona.py -r temp/bracken/${i}.report -o temp/bracken/${i}.krona --no-intermediate-ranks
    ktImportText temp/bracken/${i}.krona -o result/kraken2/krona.${i}.html
done

Pavian桑基图：https://fbreitwieser.shinyapps.io/pavian/ 在线可视化:，左侧菜单，Upload sample set (temp/bracken/*.report)，支持多样本同时上传；Sample查看结果，Configure Sankey配置图样式，Save Network下载图网页

多样性分析/物种组成，详见3StatPlot.sh，Kraken2结果筛选序列见附录

三、组装分析流程 Assemble-based

组装

# 启动工作环境
conda activate megahit

### MEGAHIT组装Assembly

# 删除旧文件夹，否则megahit无法运行
# /bin/rm -rf temp/megahit
# 组装，10~30m，TB级数据需几天至几周
megahit -t 3 \
    -1 `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/hr\//;s/$/_1.fastq/'|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \
    -2 `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/hr\//;s/$/_2.fastq/'|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \
    -o temp/megahit 
# 统计大小通常300M~5G，如果contigs太多，可以按长度筛选，降低数据量，提高基因完整度，详见附录megahit
seqkit stat temp/megahit/final.contigs.fa
# 预览重叠群最前6行，前60列字符
head -n6 temp/megahit/final.contigs.fa | cut -c1-60

# 备份重要结果
mkdir -p result/megahit/
ln -f temp/megahit/final.contigs.fa result/megahit/
# 删除临时文件
/bin/rm -rf temp/megahit/intermediate_contigs

(可选)metaSPAdes精细组装

# 精细但使用内存和时间更多，15~65m
/usr/bin/time -v -o metaspades.py.log metaspades.py -t 3 -m 100 \
  `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/qc\//;s/$/_1.fastq/'|sed 's/^/-1 /'| tr '\n' ' '` \
  `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/qc\//;s/$/_2.fastq/'|sed 's/^/-2 /'| tr '\n' ' '` \
  -o temp/metaspades
# 查看软件时间User time和内存Maximum resident set size
cat metaspades.py.log
# 2.3M，contigs体积更大
ls -sh temp/metaspades/contigs.fasta
seqkit stat temp/metaspades/contigs.fasta

# 备份重要结果
mkdir -p result/metaspades/
ln -f temp/metaspades/contigs.fasta result/metaspades/
# 删除临时文件
/bin/rm -rf temp/metaspades

注：metaSPAdes支持二、三代混合组装，见附录，此外还有OPERA-MS组装二、三代方案

QUAST评估

# QUAST评估，生成report文本tsv/txt、网页html、PDF等格式报告
quast.py result/megahit/final.contigs.fa \
  -o result/megahit/quast -t 2

(可选) megahit和metaspades比较

quast.py --label "megahit,metapasdes" \
    result/megahit/final.contigs.fa \
    result/metaspades/contigs.fasta \
    -o result/quast

(可选)metaquast评估，更全面，但需下载相关数据库，受网速影响可能时间很长(经常失败)

# metaquast based on silva, and top 50 species genome, 18min
time metaquast.py result/megahit/final.contigs.fa \
  -o result/megahit/metaquast
3.2 基因预测、去冗余和定量Gene prediction, cluster & quantitfy

metaProdigal基因预测Gene prediction

输入文件：组装的序列 result/megahit/final.contigs.fa

输出文件：prodigal预测的基因序列 temp/prodigal/gene.fa

基因大，可参考附录prodigal拆分基因文件，并行计算

mkdir -p temp/prodigal
# prodigal的meta模式预测基因，>和2>&1记录分析过程至gene.log
prodigal -i result/megahit/final.contigs.fa \
    -d temp/prodigal/gene.fa \
    -o temp/prodigal/gene.gff \
    -p meta -f gff > temp/prodigal/gene.log 2>&1 
# 查看日志是否运行完成，有无错误
tail temp/prodigal/gene.log
# 统计基因数量
seqkit stat temp/prodigal/gene.fa 
# 统计完整基因数量，数据量大可只用完整基因部分
grep -c 'partial=00' temp/prodigal/gene.fa 
# 提取完整基因(完整片段获得的基因全为完整，如成环的细菌基因组)
grep 'partial=00' temp/prodigal/gene.fa | cut -f1 -d ' '| sed 's/>//' > temp/prodigal/full_length.id
seqkit grep -f temp/prodigal/full_length.id temp/prodigal/gene.fa > temp/prodigal/full_length.fa
seqkit stat temp/prodigal/full_length.fa

cd-hit基因聚类/去冗余cluster & redundancy

输入文件：prodigal预测的基因序列 temp/prodigal/gene.fa

输出文件：去冗余后的基因和蛋白序列：result/NR/nucleotide.fa, result/NR/protein.fa

mkdir -p result/NR
# aS覆盖度，c相似度，G局部比对，g最优解，T多线程，M内存0不限制
# 2万基因2m，2千万需要2000h，多线程可加速
cd-hit-est -i temp/prodigal/gene.fa \
    -o result/NR/nucleotide.fa \
    -aS 0.9 -c 0.95 -G 0 -g 0 -T 0 -M 0
# 统计非冗余基因数量，单次拼接结果数量下降不大，多批拼接冗余度高
grep -c '>' result/NR/nucleotide.fa
# 翻译核酸为对应蛋白序列, --trim去除结尾的*
seqkit translate --trim result/NR/nucleotide.fa \
    > result/NR/protein.fa 
# 两批数据去冗余使用cd-hit-est-2d加速，见附录

salmon基因定量quantitfy

输入文件：去冗余后的基因序列：result/NR/nucleotide.fa

输出文件：Salmon定量：result/salmon/gene.count, gene.TPM

mkdir -p temp/salmon
salmon -v # 1.8.0

# 建索引, -t序列, -i 索引，10s
salmon index -t result/NR/nucleotide.fa \
  -p 3 -i temp/salmon/index 

# 定量，l文库类型自动选择，p线程，--meta宏基因组模式, 2个任务并行2个样
tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1 | rush -j 2 \
  "salmon quant -i temp/salmon/index -l A -p 3 --meta \
    -1 temp/qc/{1}_1.fastq -2 temp/qc/{1}_2.fastq \
    -o temp/salmon/{1}.quant"

合并

mkdir -p result/salmon
salmon quantmerge --quants temp/salmon/*.quant \
    -o result/salmon/gene.TPM
salmon quantmerge --quants temp/salmon/*.quant \
    --column NumReads -o result/salmon/gene.count
sed -i '1 s/.quant//g' result/salmon/gene.*

# 预览结果表格
head -n3 result/salmon/gene.*
3.3 功能基因注释Functional gene annotation
# 输入数据：上一步预测的蛋白序列 result/NR/protein.fa
# 中间结果：temp/eggnog/protein.emapper.seed_orthologs
#           temp/eggnog/output.emapper.annotations
#           temp/eggnog/output

# COG定量表：result/eggnog/cogtab.count
#            result/eggnog/cogtab.count.spf (用于STAMP)

# KO定量表：result/eggnog/kotab.count
#           result/eggnog/kotab.count.spf  (用于STAMP)

# CAZy碳水化合物注释和定量：result/dbcan3/cazytab.count
#                           result/dbcan3/cazytab.count.spf (用于STAMP)

# 抗生素抗性：result/resfam/resfam.count
#             result/resfam/resfam.count.spf (用于STAMP)

# 这部分可以拓展到其它数据库

eggNOG基因注释gene annotation(COG/KEGG/CAZy)

软件主页：https://github.com/eggnogdb/eggnog-mapper

# 运行并记录软件版本
conda activate eggnog
emapper.py --version
# emapper-2.1.7 / Expected eggNOG DB version: 5.0.2 
# Diamond version found: diamond version 2.0.15

# 运行emapper，18m，默认diamond 1e-3
mkdir -p temp/eggnog
time emapper.py --data_dir ${db}/eggnog \
  -i result/NR/protein.fa --cpu 3 -m diamond --override \
  -o temp/eggnog/output

# 格式化结果并显示表头
grep -v '^##' temp/eggnog/output.emapper.annotations | sed '1 s/^#//' \
  > temp/eggnog/output
csvtk -t headers -v temp/eggnog/output

生成COG/KO/CAZy丰度汇总表

mkdir -p result/eggnog
# 显示帮助
summarizeAbundance.py -h
# 汇总，7列COG_category按字母分隔，12列KEGG_ko和19列CAZy按逗号分隔，原始值累加
summarizeAbundance.py \
  -i result/salmon/gene.TPM \
  -m temp/eggnog/output --dropkeycolumn \
  -c '7,12,19' -s '*+,+,' -n raw \
  -o result/eggnog/eggnog
sed -i 's#^ko:##' result/eggnog/eggnog.KEGG_ko.raw.txt
sed -i '/^-/d' result/eggnog/eggnog*
head -n3 result/eggnog/eggnog*
# eggnog.CAZy.raw.txt  eggnog.COG_category.raw.txt  eggnog.KEGG_ko.raw.txt

# 添加注释生成STAMP的spf格式
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$2} NR>FNR{print a[$1],$0}' \
  ${db}/EasyMicrobiome/kegg/KO_description.txt \
  result/eggnog/eggnog.KEGG_ko.raw.txt | \
  sed 's/^\t/Unannotated\t/' \
  > result/eggnog/eggnog.KEGG_ko.TPM.spf
head -n 5 result/eggnog/eggnog.KEGG_ko.TPM.spf
# KO to level 1/2/3
summarizeAbundance.py \
  -i result/eggnog/eggnog.KEGG_ko.raw.txt \
  -m ${db}/EasyMicrobiome/kegg/KO1-4.txt \
  -c 2,3,4 -s ',+,+,' -n raw --dropkeycolumn \
  -o result/eggnog/KEGG
head -n3 result/eggnog/KEGG*

# CAZy
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$2} NR>FNR{print a[$1],$0}' \
   ${db}/EasyMicrobiome/dbcan2/CAZy_description.txt result/eggnog/eggnog.CAZy.raw.txt | \
  sed 's/^\t/Unannotated\t/' > result/eggnog/eggnog.CAZy.TPM.spf
head -n 3 result/eggnog/eggnog.CAZy.TPM.spf

# COG
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$2"\t"$3} NR>FNR{print a[$1],$0}' \
  ${db}/EasyMicrobiome/eggnog/COG.anno result/eggnog/eggnog.COG_category.raw.txt > \
  result/eggnog/eggnog.COG_category.TPM.spf
head -n 3 result/eggnog/eggnog.COG_category.TPM.spf

CAZy碳水化合物酶

# 比对CAZy数据库, 用时2~18m
mkdir -p temp/dbcan3 result/dbcan3
# --sensitive慢10倍，dbcan3e值为1e-102，此处以1e-3演示
time diamond blastp \
  --db ${db}/dbcan3/CAZyDB \
  --query result/NR/protein.fa \
  --threads 2 -e 1e-3 --outfmt 6 --max-target-seqs 1 --quiet \
  --out temp/dbcan3/gene_diamond.f6
wc -l temp/dbcan3/gene_diamond.f6
# 提取基因与dbcan分类对应表
format_dbcan2list.pl \
  -i temp/dbcan3/gene_diamond.f6 \
  -o temp/dbcan3/gene.list 
# 按对应表累计丰度，依赖
summarizeAbundance.py \
  -i result/salmon/gene.TPM \
  -m temp/dbcan3/gene.list \
  -c 2 -s ',' -n raw --dropkeycolumn \
  -o result/dbcan3/TPM
# 添加注释生成STAMP的spf格式，结合metadata.txt进行差异比较
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$2} NR>FNR{print a[$1],$0}' \
   ${db}/EasyMicrobiome/dbcan2/CAZy_description.txt result/dbcan3/TPM.CAZy.raw.txt | \
  sed 's/^\t/Unannotated\t/' \
  > result/dbcan3/TPM.CAZy.raw.spf
head result/dbcan3/TPM.CAZy.raw.spf
# 检查未注释数量，有则需要检查原因
grep 'Unannotated' result/dbcan3/TPM.CAZy.raw.spf|wc -l

CARD耐药基因

CARD在线分析平台：https://card.mcmaster.ca/ 
本地软件使用教程: https://github.com/arpcard/rgi
参考文献：http://doi.org/10.1093/nar/gkz935
结果说明：protein.json，在线可视化；protein.txt，注释基因列表

mkdir -p result/card
# 启动rgi环境和记录版本
conda activate rgi6
rgi main -v # 6.0.3

# 简化蛋白ID
cut -f 1 -d ' ' result/NR/protein.fa > temp/protein.fa
# 这个错误忽略即可，不是报错，没有任何影响  grep: 写错误: 断开的管道
grep '>' result/NR/protein.fa | head -n 3
grep '>' temp/protein.fa | head -n 3
# 蛋白层面注释ARG
rgi main -i temp/protein.fa -t protein \
  -n 9 -a DIAMOND --include_loose --clean \
  -o result/card/protein
head -n3 result/card/protein.txt

# 基因层面注释ARG
cut -f 1 -d ' ' result/NR/nucleotide.fa > temp/nucleotide.fa
grep '>' temp/nucleotide.fa | head -n3
rgi main -i temp/nucleotide.fa -t contig \
  -n 9 -a DIAMOND --include_loose --clean \
  -o result/card/nucleotide
head -n3 result/card/nucleotide.txt

# 重叠群层面注释ARG
cut -f 1 -d ' ' result/megahit/final.contigs.fa > temp/contigs.fa
grep '>' temp/contigs.fa | head -n3
rgi main -i temp/contigs.fa -t contig \
  -n 9 -a DIAMOND --include_loose --clean \
  -o result/card/contigs
head result/card/contigs.txt
3.4 基因物种注释
# Generate report in default taxid output
conda activate kraken2
kraken2 --db ${db}/kraken2/pluspf16g \
  result/NR/nucleotide.fa \
  --threads 3 \
  --report temp/NRgene.report \
  --output temp/NRgene.output
# Genes & taxid list
grep '^C' temp/NRgene.output | cut -f 2,3 | sed '1 i Name\ttaxid' \
  > temp/NRgene.taxid
# Add taxonomy
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print $1,a[$2]}' \
  $db/EasyMicrobiome/kraken2/taxonomy.txt \
  temp/NRgene.taxid > result/NR/nucleotide.tax
conda activate eggnog 
summarizeAbundance.py \
  -i result/salmon/gene.TPM \
  -m result/NR/nucleotide.tax  --dropkeycolumn \
  -c '2,3,4,5,6,7,8,9' -s ',+,+,+,+,+,+,+,' -n raw \
  -o result/NR/tax
wc -l result/NR/tax*|sort -n

四、分箱挖掘单菌基因组Binning

4.1 MetaWRAP混合样本分箱 Samples binning

主页：https://github.com/bxlab/metaWRAP

教程: https://github.com/bxlab/metaWRAP/blob/master/Usage_tutorial.md

挖掘单菌基因组，需要研究对象复杂度越低、测序深度越大，结果质量越好。要求单样本6GB+，复杂样本如土壤推荐数据量30GB+，至少3个样本

演示数据12个样仅140MB，无法获得单菌基因组，这里使用官方测序数据演示讲解

软件和数据库布置需1-3天，演示数据分析过程超10h，30G样也需1-30天，由服务器性能决定。

# 设置并进入工作目录
wd=~/meta/binning
mkdir -p ${wd} && cd ${wd}
# 初始化项目
mkdir -p temp/hr seq result
# 启动metawrap环境
conda activate metawrap

数据和环境变量 Data and enviroment

这里基于质控clean数据和拼接好的重叠群contigs，基于上游结果继续分析。由于上游测试数据过小，分箱无结果。 本次采用软件推荐的7G数据，我们进入一个新文件夹开展分析。

输入输出文件介绍：

# 输入：质控后序列，文件名格式为*_1.fastq和*_2.fastq，temp/qc 目录下，如C1_1.fastq、C1_2.fastq 
# 组装的重叠群文件：result/megahit/final.contigs.fa

# 输出：
#     Binning结果：temp/binning
#     提纯后的Bin统计结果：temp/bin_refinement/metawrap_50_10_bins.stats
#     Bin定量结果文件和图：binning/temp/bin_quant/bin_abundance_table.tab 和 bin_abundance_heatmap.png
#     Bin物种注释：binning/temp/bin_classify/bin_taxonomy.tab
#     Prokka基因预测：binning/temp/bin_annotate/prokka_out/bin.*.ffn 核酸序列
#     Bin可视化图表：binning/temp/bloblogy/final.contigs.binned.blobplot (数据表) 和 blobplot_figures (可视化图)

准备输入文件：原始数据+组装结果

质控后数据位于temp/qc中，此处需下载并解压

# 方法1. 直接拷贝
/bin/cp -rf /db/metawrap/*.fastq ~/meta/binning/temp/hr/
# 方法2. 在线下载
cd temp/hr
for i in `seq 7 9`;do
    wget -c ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/ERR011/ERR01134${i}/ERR01134${i}_1.fastq.gz
    wget -c ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/ERR011/ERR01134${i}/ERR01134${i}_2.fastq.gz
done
gunzip -k *.gz
# 批量修改扩展名fq为fastq
# rename .fq .fastq *.fq

megahit拼接结果

cd ${wd}
mkdir -p temp/megahit
cd temp/megahit
# 可从EasyMetagenome目录复制，或链接下载
wget -c http://www.imeta.science/db/metawrap/final.contigs.fa.gz
gunzip -k *.gz
cd ${wd}

分箱Binning

# 加载运行环境
cd ${wd}
conda activate metawrap
metawrap -v # 1.3.2

# 输入文件为contig和clean reads
# 调用maxbin2, metabat2，8p线程2h，24p耗时1h；-concoct 3h
nohup metawrap binning -o temp/binning \
  -t 3 -a temp/megahit/final.contigs.fa \
  --metabat2 --maxbin2 \
  temp/hr/*.fastq
#  --concoct > /dev/null 2>&1 增加3~10倍计算量，添加/dev/null清除海量Warning信息

分箱提纯Bin refinement

# 8线程2h， 24p 1.3h；2方法16p 20m
metawrap bin_refinement \
  -o temp/bin_refinement \
  -A temp/binning/metabat2_bins/ \
  -B temp/binning/maxbin2_bins/ \
  -c 50 -x 10 -t 8
# -C temp/binning/concoct_bins/ \
# 统计高质量Bin的数量，2方法6个，3方法9个
tail -n+2 temp/bin_refinement/metawrap_50_10_bins.stats|wc -l
# 分析比较图见 temp/bin_refinement/figures/

所有分箱至同一目录All bins in one directory

mkdir -p temp/drep_in
# 混合组装分箱链接和重命名
ln -s `pwd`/temp/bin_refinement/metawrap_50_10_bins/bin.* temp/drep_in/
ls -l temp/drep_in/
# 改名CentOS
rename 'bin.' 'Mx_All_' temp/drep_in/bin.*
# 改名Ubuntu
rename s/bin./Mx_All_/ temp/drep_in/bin.*
ls temp/drep_in/Mx*

(可选Opt)单样本分箱Single sample binning

多样本受硬件、计算时间限制无法完成时，需要单样本组装、分箱。多样本信息丰度，分箱结果更多，更容易降低污染。详见：- Nature Methods | 单样本与多样本宏基因组分箱的比较揭示了广泛存在的隐藏性污染
**设置全局线程、并行任务数和筛选分箱的条件**

# p:threads线程数,job任务数,complete完整度x:contaminate污染率
conda activate metawrap
p=16
j=3
c=50
x=10

(可选)并行需要样本列表，请提前编写metadata.txt保存于result中

# 快速读取文件生成样本ID列表再继续编写
ls temp/hr/ | grep _1 | cut -f 1 -d '_' | sort -u | sed '1 i SampleID' > result/metadata.txt
# 预览
cat result/metadata.txt

**组装Assemble**

单样本并行组装；支持中断继续运行

tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j ${j} \
  "metawrap assembly -m 200 -t ${p} --megahit \
    -1 temp/hr/{}_1.fastq -2 temp/hr/{}_2.fastq \
    -o temp/megahit/{}"

**分箱binning**

单样本并行分箱，192p, 15m (concoct使用超多线程)；16p 2d/sample, >/dev/null 16p 12h/sample

time tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j ${j} \
  "metawrap binning \
    -o temp/binning/{} -t ${p} \
    -a temp/megahit/{}/final_assembly.fasta \
    --metabat2 --maxbin2 --concoct \
    temp/hr/{}_*.fastq > /dev/null 2>&1" 

**分箱提纯bin refinement**

time tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j ${j} \
  "metawrap bin_refinement \
  -o temp/bin_refinement/{} -t ${p} \
  -A temp/binning/{}/metabat2_bins/ \
  -B temp/binning/{}/maxbin2_bins/ \
  -C temp/binning/{}/concoct_bins/ \
  -c ${c} -x ${x} "
# 分别为1,2,2个
tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j 1 \
  "tail -n+2 temp/bin_refinement/{}/metawrap_50_10_bins.stats|wc -l "

单样品分箱链接和重命名

for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
   ln -s `pwd`/temp/bin_refinement/${i}/metawrap_50_10_bins/bin.* temp/drep_in/
   # CentOS
   rename 'bin.' "Sg_${i}_" temp/drep_in/bin.*
   # Ubuntu
   rename "s/bin./Sg_${i}_/" temp/drep_in/bin.*
done
# 删除空白中无效链接
/bin/rm -f temp/drep_in/*\*
# 统计混合和单样本来源数据，10个混，5个单；不同系统结果略有差异
ls temp/drep_in/|cut -f 1 -d '_'|uniq -c
# 统计混合批次/单样本来源
ls temp/drep_in/|cut -f 2 -d '_'|cut -f 1 -d '.' |uniq -c

(可选Opt)分组分箱 Subgroup binning

样本>30或数据量>300G在1TB内存胖结点上完成混合组装和分箱可能内存不足、且时间>1周甚至1月，需要对研究相近条件、地点进行分小组，且每组编写一个metadata??.txt。

conda activate metawrap
# 小组ID: A1/A2/A3
g=A1

**组装Assemble**：<30个或<300G样本，~12h

metawrap assembly -m 600 -t 32 --megahit \
  -1 `tail -n+2 result/metadata${g}.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/hr\//;s/$/_1.fastq/'|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \
  -2 `tail -n+2 result/metadata${g}.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/hr\//;s/$/_2.fastq/'|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \
  -o temp/megahit_${g}

**分箱Binning**，~18h

# 链接文件到临时位置
mkdir -p temp/${g}/
for i in `tail -n+2 result/metadata${g}.txt|cut -f1`;do
    ln -s `pwd`/temp/hr/${i}*.fastq temp/${g}/
done
# 按组分箱
metawrap binning -o temp/binning_${g} \
  -t 32 -a temp/megahit_${g}/final_assembly.fasta \
  --metabat2 --maxbin2 \
  temp/${g}/*.fastq

**分箱提纯Bin refinement**

metawrap bin_refinement \
  -o temp/bin_refinement_${g} \
  -A temp/binning_${g}/metabat2_bins/ \
  -B temp/binning_${g}/maxbin2_bins/ \
  -c 50 -x 10 -t 32
# 统计高质量Bin的数量
wc -l temp/bin_refinement_${g}/metawrap_50_10_bins.stats

**改名汇总 Rename & merge**

mkdir -p temp/drep_in
# 混合组装分箱链接和重命名
ln -s `pwd`/temp/bin_refinement_${g}/metawrap_50_10_bins/bin.* temp/drep_in/
# 改名
rename "s/bin./Gp_${g}_/" temp/drep_in/bin.* # Ubuntu
# rename 'bin.' "Gp_${g}_" temp/drep_in/bin.* # CentOS
# 统计
mkdir -p result/bin
echo -n $g >> result/bin/groupNo.txt
ls temp/drep_in/Gp_${g}_*|wc>> result/bin/groupNo.txt
cat result/bin/groupNo.txt
4.2 dRep去冗余种/株基因组集
# 进入虚拟环境drep和工作目录
conda activate drep
cd ${wd}

按种水平去冗余：6~40min，15个为10个，8个来自混拼，2个来自单拼

mkdir -p temp/drep95
# /bin/rm -rf temp/drep95/data/checkM
time dRep dereplicate temp/drep95/ \
  -g temp/drep_in/*.fa  \
  -sa 0.95 -nc 0.30 -comp 50 -con 10 -p 5
# 报错日志在temp/drep95/log/cmd_logs中查看，加-d显示更多
ls temp/drep95/dereplicated_genomes/|cut -f 1 -d '_'|sort|uniq -c

主要结果temp/drep95中：

*   非冗余基因组集：temp/drep95/dereplicated_genomes/*.fa
*   聚类信息表：temp/drep95/data_tables/Cdb.csv
*   聚类和质量图：temp/drep95/figures/*clustering*

(可选)按株水平99%去冗余，20-30min，本处也为10个

mkdir -p temp/drep99
time dRep dereplicate temp/drep99/ \
  -g temp/drep_in/*.fa \
  -sa 0.99 -nc 0.30 -comp 50 -con 10 -p 5
ls -l temp/drep99/dereplicated_genomes/ | grep '.fa' | wc -l
4.3 CoverM基因组定量
# 启动环境
conda activate coverm
mkdir -p temp/coverm

# (可选)单样本测试, 3min
i=ERR011347
time coverm genome --coupled temp/hr/${i}_1.fastq temp/hr/${i}_2.fastq \
  --genome-fasta-directory temp/drep95/dereplicated_genomes/ -x fa \
  -o temp/coverm/${i}.txt
cat temp/coverm/${i}.txt

# 并行计算, 4min
tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j 2 \
  "coverm genome --coupled temp/hr/{}_1.fastq temp/hr/{}_2.fastq \
  --genome-fasta-directory temp/drep95/dereplicated_genomes/ -x fa \
  -o temp/coverm/{}.txt"

# 结果合并
mkdir -p result/coverm
conda activate humann3
sed -i 's/_1.fastq Relative Abundance (%)//' temp/coverm/*.txt
humann_join_tables --input temp/coverm \
  --file_name txt \
  --output result/coverm/abundance.tsv

# 按组求均值，需要metadata中有3列且每个组有多个样本
Rscript ${db}/EasyMicrobiome/script/otu_mean.R --input result/coverm/abundance.tsv \
  --metadata result/metadata.txt \
  --group Group --thre 0 \
  --scale TRUE --zoom 100 --all TRUE --type mean \
  --output result/coverm/group_mean.txt
# https://www.bic.ac.cn/ImageGP/ 直接选择热图可视化
4.4 GTDB-tk物种注释和进化树

启动软件所在虚拟环境

conda activate gtdbtk2.3
export GTDBTK_DATA_PATH="${db}/gtdb"
gtdbtk -v # 2.3.2

代表性细菌基因组物种注释

mkdir -p temp/gtdb_classify
# 10个基因组，24p，100min 152G内存; 6p, 22基因组，1h
gtdbtk classify_wf \
    --genome_dir temp/drep95/dereplicated_genomes \
    --out_dir temp/gtdb_classify \
    --extension fa --skip_ani_screen \
    --prefix tax \
    --cpus 6
# less -S按行查看，按q退出
less -S temp/gtdb_classify/tax.bac120.summary.tsv
less -S temp/gtdb_classify/tax.ar53.summary.tsv

代表种注释：以上面鉴定的10个种为例，注意扩展名要与输入文件一致，可使用压缩格式gz。主要结果文件描述：此9个细菌基因组在tax.bac120.summary.tsv。古菌在tax.ar53开头的文件中。

(可选)所有MAG物种注释

mkdir -p temp/gtdb_all
# 10000个基因组，32p，100min
time gtdbtk classify_wf \
    --genome_dir temp/drep_in/ \
    --out_dir temp/gtdb_all \
    --extension fa --skip_ani_screen \
    --prefix tax \
    --cpus 6
less -S temp/gtdb_all/tax.bac120.summary.tsv
less -S temp/gtdb_all/tax.ar53.summary.tsv

多序列对齐结果建树

以9个细菌基因组的120个单拷贝基因建树，1s

mkdir -p temp/gtdb_infer
gtdbtk infer --msa_file temp/gtdb_classify/align/tax.bac120.user_msa.fasta.gz \
    --out_dir temp/gtdb_infer --prefix tax --cpus 3

树文件tax.unrooted.tree可使用iTOL在线美化，也可使用GraphLan本地美化。

制作树注释文件：以gtdb-tk物种注释(tax.bac120.summary.tsv)和drep基因组评估(Widb.csv)信息为注释信息

mkdir -p result/itol
# 制作分类学表
tail -n+2 temp/gtdb_classify/tax.bac120.summary.tsv|cut -f 1-2|sed 's/;/\t/g'|sed '1 s/^/ID\tDomain\tPhylum\tClass\tOrder\tFamily\tGenus\tSpecies\n/' \
  > result/itol/tax.txt
head result/itol/tax.txt
# 基因组评估信息
sed 's/,/\t/g;s/.fa//' temp/drep95/data_tables/Widb.csv|cut -f 1-7,11|sed '1 s/genome/ID/' \
  > result/itol/genome.txt
head result/itol/genome.txt
# 整合注释文件
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print $0,a[$1]}' result/itol/genome.txt result/itol/tax.txt|cut -f 1-8,10- > result/itol/annotation.txt
head result/itol/annotation.txt
# 添加各样本相对丰度(各组替换均值)
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print $0,a[$1]}' <(sed '1 s/Genome/ID/' result/coverm/abundance.tsv) result/itol/annotation.txt|cut -f 1-15,17- > result/itol/annotation2.txt
head result/itol/annotation2.txt    

CheckM2重新评估

conda activate checkm2
mkdir -p temp/checkm2 result/checkm2
# 10 genomes, 2m
time checkm2 predict --input temp/drep95/dereplicated_genomes/*   --output-directory temp/checkm2 --threads 8
ln temp/checkm2/quality_report.tsv result/checkm2/
# 查看结果
less result/checkm2//quality_report.tsv 

五、(可选)单菌基因组

5.1 Fastp质量控制
# 每个样本~30s，173个j2共
mkdir -p temp/qc/ 
time tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f1 | rush -j 2 \
  "time fastp -i seq/{1}_1.fq.gz -I seq/{1}_2.fq.gz \
    -j temp/qc/{1}_fastp.json -h temp/qc/{1}_fastp.html \
    -o temp/qc/{1}_1.fastq -O temp/qc/{1}_2.fastq \
    > temp/qc/{1}.log 2>&1"
5.2 metaspades组装
conda activate megahit
spades.py -v # v3.15.4，>3.14.0才支持--isolate模式
mkdir -p temp/spades result/spades
# 127 genoms, 1m17s
time tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j 3 \
"spades.py --pe1-1 temp/qc/{1}_1.fastq \
  --pe1-2 temp/qc/{1}_2.fastq \
  -t 16 --isolate --cov-cutoff auto \
  -o temp/spades/{1}" 

# 筛选>1k的序列并汇总、统计
time tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|rush -j 3 \
  "seqkit seq -m 1000 temp/spades/{1}/contigs.fasta \
    > temp/spades/{1}.fa"
seqkit stat temp/spades/*.fa | sed 's/temp\/spades\///;s/.fa//' > result/spades/stat1k.txt
5.3 checkm质量评估
checkm评估质量

conda activate drep
checkm # CheckM v1.1.2
mkdir -p temp/checkm result/checkm
# 127 genoms, 1m17s
time checkm lineage_wf -t 8 -x fa temp/spades/ temp/checkm
# format checkm jason to tab
checkmJason2tsv.R -i temp/checkm/storage/bin_stats_ext.tsv \
  -o temp/checkm/bin_stats.txt
csvtk -t  pretty temp/checkm/bin_stats.txt | less

(可选)checkm2评估(测试中…)

conda activate checkm2
mkdir -p temp/checkm2
time checkm2 predict --threads 8 --input temp/spades/ --output-directory temp/checkm2

筛选污染和高质量基因组 >5% contamination and high quailty

awk '$5<90 || $10>5' temp/checkm/bin_stats.txt | csvtk -t cut -f 1,5,10,4,9,2 > temp/checkm/contamination5.txt
tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|wc -l 
# 筛选高质量用于下游分析 <5% high-quality for down-stream analysis
awk '$5>=90 && $10<=5' temp/checkm/bin_stats.txt | csvtk -t cut -f 1,5,10,4,9,2 | sed '1 i ID\tCompleteness\tContamination\tGC\tN50\tsize' > result/checkm/Comp90Cont5.txt
tail -n+2 result/checkm/Comp90Cont5.txt|wc -l 
# 链接高质量基因组至新目录，单菌完整度通常>99%
mkdir -p temp/drep_in/
for n in `tail -n+2 result/checkm/Comp90Cont5.txt|cut -f 1`;do
  ln temp/spades/${n}.fa temp/drep_in/
done
5.4 混菌metawarp分箱

分箱和提纯binning & refinement

conda activate metawrap
mkdir -p temp/binning temp/bin
time tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|cut -f1|rush -j 3 \
  "metawrap binning \
    -o temp/binning/{} -t 8 \
    -a temp/spades/{}/contigs.fasta \
    --metabat2 --maxbin2 \
    temp/qc/{}_*.fastq" 
time tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|cut -f1|rush -j 15 \
  "metawrap bin_refinement \
  -o temp/bin/{} -t 8 \
  -A temp/binning/{}/metabat2_bins/ \
  -B temp/binning/{}/maxbin2_bins/ \
  -c 50 -x 10"

分箱结果汇总

echo -n -e "" > temp/bin/metawrap.stat
for m in `tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|cut -f1`;do
  echo ${m} >> temp/bin/metawrap.stat
  cut -f1-4,6-7 temp/bin/${m}/metawrap_50_10_bins.stats >> temp/bin/metawrap.stat
done
# 分箱后的按b1,b2,b3重命名共培养，单菌也可能减少污染
for m in `tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|cut -f1`;do
    c=1
    for n in `tail -n+2 temp/bin/$m/metawrap_50_10_bins.stats|cut -f 1`;do
      cp temp/bin/$m/metawrap_50_10_bins/${n}.fa temp/drep_in/${m}b${c}.fa
      ((c++))
done
done

分箱前后统计比较

# 如107个测序分箱为352个基因组，共418个基因组
tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|wc -l
ls temp/drep_in/*b?.fa | wc -l
ls temp/drep_in/*.fa | wc -l
# 重建新ID列表，A代表所有，B代表Bin分箱过的单菌
ls temp/drep_in/*.fa|cut -f 3 -d '/'|sed 's/.fa//'|sed '1 i ID'|less -S>result/metadataA.txt
ls temp/drep_in/*b?.fa|cut -f 3 -d '/'|sed 's/.fa//'|sed '1 i ID'|less -S>result/metadataB.txt

可视化混菌中覆盖度分布，以第一污染菌为例

i=`tail -n+2 temp/checkm/contamination5.txt|head -n1|cut -f1`
# grep '>' temp/spades/${i}.fa|cut -f 2,4,6 -d '_'|sed 's/^/C/;s/_/\t/g'|sed '1i Contig\tLength\tCoverage'>temp/spades/${i}.len
grep '>' temp/drep_in/${i}*|cut -f 3 -d '/'|sed 's/.fa:>NODE//'|cut -f 1,2,4,6 -d '_'|sed 's/_/\t/g'|sed '1i Genome\tContig\tLength\tvalue' > temp/drep_in/${i}.cov
sp_lines.sh -f temp/drep_in/${i}.cov -m TRUE -A TRUE -a Contig -H Genome
5.5 drep基因组去冗余
mkdir -p temp/drep95/
conda activate drep
# 相似度sa 0.99995 去重复, 0.99 株水平, 0.95 种水平
dRep dereplicate \
  -g temp/drep_in/*.fa \
  -sa 0.95 -nc 0.3 -p 16 -comp 50 -con 10 \
  temp/drep95
# 统计总和使用基因组数据，确保没有异常丢弃stat total and used genomes, keep no abnormal discard
ls temp/drep_in/*.fa|wc -l
grep 'passed checkM' temp/drep95/log/logger.log|sed 's/[ ][ ]*/ /g'|cut -f 4 -d ' '
# 去冗余后数量，418变为49种
ls temp/drep95/dereplicated_genomes/|wc -l
# 唯一和重复的基因组unique and duplicate genome
csvtk cut -f 11 temp/drep95/data_tables/Widb.csv | sort | uniq -c
# 整理种列表
echo "SampleID" > result/metadataS.txt
ls temp/drep95/dereplicated_genomes/|sed 's/\.fa//' >> result/metadataS.txt
5.6 gtdb物种注释
conda activate gtdbtk2.3

# 所有基因组注释，400g, 1h, 1T
mkdir -p temp/gtdb_all result/gtdb_all
memusg -t gtdbtk classify_wf \
  --genome_dir temp/drep_in/ \
  --out_dir temp/gtdb_all/ \
  --extension fa --skip_ani_screen \
  --prefix tax \
  --cpus 16
# 基因组信息genomeInfo.csv 
sed 's/,/\t/g;s/.fa//' temp/drep95/data_tables/genomeInfo.csv |sed '1 s/genome/ID/' > result/gtdb_all/genome.txt

# 95%聚类种基因组注释，40g, 1h, 500G
mkdir -p temp/gtdb_95 result/gtdb_95
# Taxonomy classify 
memusg -t gtdbtk classify_wf \
  --genome_dir temp/drep95/dereplicated_genomes/ \
  --out_dir temp/gtdb_95 \
  --extension fa --skip_ani_screen \
  --prefix tax \
  --cpus 8
# Phylogenetic tree infer
memusg -t gtdbtk infer \
  --msa_file temp/gtdb_95/align/tax.bac120.user_msa.fasta.gz \
  --out_dir temp/gtdb_95 \
  --cpus 8 --prefix g >> temp/gtdb_95/infer.log 2>&1
ln `pwd`/temp/gtdb_95/infer/intermediate_results/g.unrooted.tree result/gtdb_95/

# 细菌format to standard 7 levels taxonomy 
tail -n+2 temp/gtdb_95/classify/tax.bac120.summary.tsv|cut -f 1-2|sed 's/;/\t/g'|sed '1 s/^/ID\tKingdom\tPhylum\tClass\tOrder\tFamily\tGenus\tSpecies\n/' > result/gtdb_95/tax.bac.txt
# 古菌(可选)
tail -n+2 temp/gtdb_95/classify/tax.ar122.summary.tsv|cut -f 1-2|sed 's/;/\t/g'|sed '1 s/^/ID\tKingdom\tPhylum\tClass\tOrder\tFamily\tGenus\tSpecies\n/' > result/gtdb_95/tax.ar.txt
cat result/gtdb_95/tax.bac.txt <(tail -n+2 result/gtdb_95/tax.ar.txt) > result/gtdb_95/tax.txt

# Widb.csv 非冗余基因组信息
sed 's/,/\t/g;s/.fa//' temp/drep95/data_tables/Widb.csv|cut -f 1-7,11|sed '1 s/genome/ID/' > result/gtdb_95/genome.txt
# 整合物种注释和基因组信息 Integrated taxonomy and genomic info 
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"} NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print $0,a[$1]}' result/gtdb_95/genome.txt result/gtdb_95/tax.txt|cut -f 1-8,10- > result/gtdb_95/annotation.txt
# csvtk -t headers -v result/gtdb_95/annotation.txt

# 制作itol files
cd result/gtdb_95
table2itol.R -D plan1 -a -c double -i ID -l Genus -t %s -w 0.5 annotation.txt
table2itol.R -D plan2 -a -d -c none -b Phylum -i ID -l Genus -t %s -w 0.5 annotation.txt
table2itol.R -D plan3 -c keep -i ID -t %s annotation.txt
table2itol.R -D plan4 -a -c factor -i ID -l Genus -t %s -w 0 annotation.txt
# Stat each level
echo -e 'Taxonomy\tKnown\tNew' > tax.stat
for i in `seq 2 8`;do
  head -n1 tax.txt|cut -f ${i}|tr '\n' '\t' >> tax.stat
  tail -n+2 tax.txt|cut -f ${i}|grep -v '__$'|sort|uniq -c|wc -l|tr '\n' '\t' >> tax.stat
  tail -n+2 tax.txt|cut -f ${i}|grep '__$'|wc -l >> tax.stat; done
cat tax.stat
tail -n+2 tax.txt|cut -f3|sort|uniq -c|awk '{print $2"\t"$1}'|sort -k2,2nr > count.phylum
cat count.phylum
cd ../..
5.7 功能注释eggnog/dbcan/arg/antismash

基因注释

mkdir -p temp/prodigal
conda activate eggnog
prodigal -v # V2.6.3
# 50g, 31s, 4m
time tail -n+2 result/metadataS.txt|cut -f1|rush -j 10 \
"prodigal \
  -i temp/drep95/dereplicated_genomes/{1}.fa \
  -o temp/prodigal/{1}.gff  \
  -a temp/prodigal/{1}.faa \
  -d temp/prodigal/{1}.ffn \
  -p single -f gff" 
seqkit stat temp/prodigal/*.ffn | sed 's/temp\/prodigal\///;s/\.ffn//;s/[[:blank:]]\{1,\}/\t/g' | cut -f 1,3-  \
  > result/prodigal.txt

碳水化合物注释

mkdir -p temp/dbcan3 result/dbcan3
time tail -n+2 result/metadataS.txt|cut -f1|rush -j 9 \
"diamond blastp \
  --db ${db}/dbcan3/CAZyDB \
  --query temp/prodigal/{1}.faa \
  --outfmt 6 --threads 8 --quiet --log \
  --evalue 1e-102 --max-target-seqs 1 --sensitive \
  --block-size 6 --index-chunks 1 \
  --out temp/dbcan3/{1}_diamond.f6"
wc -l temp/dbcan3/*.f6|head -n-1|awk '{print $2"\t"$1}'|cut -f3 -d '/'|sed 's/_diamond.f6//'|sed '1 i ID\tCAZy'|less -S > result/dbcan3/gene.count
# format blast2genelist
for i in `tail -n+2 result/metadataS.txt|cut -f1`;do
format_dbcan3list.pl \
  -i temp/dbcan3/${i}_diamond.f6 \
  -o temp/dbcan3/${i}.list
done
# CAZy type count
for i in `tail -n+2 result/metadataS.txt|cut -f1`;do
  tail -n+2 temp/dbcan3/${i}.list|cut -f2|sort|uniq -c|awk '{print $2"\t"$1}'|sed "1 i CAZy\t${i}"|less -S > temp/dbcan3/${i}_CAZy.tsv
done
# merge2table
conda activate humann3
humann_join_tables \
  --input temp/dbcan3/ --file_name CAZy \
  --output result/dbcan3/cazy.txt
csvtk -t stat result/dbcan3/cazy.txt
# merge to level1
paste <(cut -f1 result/dbcan3/cazy.txt) <(cut -f1 result/dbcan3/cazy.txt|tr '0-9' ' '|sed 's/ //g') | sed '1 s/\tCAZy/\tLevel1/' >  result/dbcan3/cazy.L1
summarizeAbundance.py \
  -i result/dbcan3/cazy.txt \
  -m result/dbcan3/cazy.L1 \
  -c 2 -s ',' -n raw  --dropkeycolumn \
  -o result/dbcan3/sum
# 基因相似度
echo -e 'Name\tCAZy\tIdentity\tGenome' > result/dbcan3/identity.txt
for i in `tail -n+2 result/metadataS.txt|cut -f1`;do
  csvtk -t replace -f 2 -p "\d+" -r "" temp/dbcan3/${i}.list | uniq | tail -n+2 | sed "s/$/\t${i}/" >> result/dbcan3/identity.txt
done
csvtk -t stat result/dbcan3/identity.txt
sp_boxplot.sh -f result/dbcan3/identity.txt -m T -F CAZy -d Identity

耐药基因

mkdir -p temp/card result/card
conda activate rgi6
# load database 加载数据库
rgi load -i ${db}/card/card.json \
  --card_annotation ${db}/card/card.fasta --local
# Annotation 蛋白注释
# 默认为0, --include_loose 可极大增加结果，519/4657=11.14%;  --exclude_nudge结果不变，但jason为空
time for i in `tail -n+2 result/metadataS.txt|cut -f1`;do
# i=X004b2
cut -f 1 -d ' ' temp/prodigal/${i}.faa | sed 's/\*//' > temp/prodigal/protein_${i}.fa
rgi main \
  --input_sequence temp/prodigal/protein_${i}.fa \
  --output_file temp/card/${i} \
  --input_type protein --clean \
  --num_threads 8 --alignment_tool DIAMOND > temp/log 2>&1
done

附录：常见分析问题和补充代码

计算时间统计表

在60核§及以上服务器，单样本3个并行推荐16p，混合组装分箱推荐32p。

小数据：2个7.5M样本，在72个核、512GB服务器上测试。
大数据：20个10G样本，在192个核、2TB大内存服务器上测试。

步骤数据小(6Gx3)数据(10Gx20)备注
fastqc33s15m
seqkit2s15m
fastp2s40m
kneaddata25s5h
humann34m30h
megahit39s15h
binning6h16h-concoct
binrefine2h3h
coverm4m30m

注：m为分，h为小时，d为天

补充代码Supplementary scripts

**for循环批量处理样本列表**

基于样本元数据提取样本列表命令解析

去掉表头

tail -n+2 result/metadata.txt

提取第一列样本名

tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1

循环处理样本

for i in tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1;do echo "Processing "$i; done

` 反引号为键盘左上角Esc键下面的按键，一般在数字1的左边，代表运行命令返回结果

质控去宿主KneadData

**双端序列质控后是否配对的检查**

双端序列质控后序列数量不一致是肯定出错了。但即使序列数量一致，也可能序列不对。在运行metawrap分箱时会报错。可以kneaddata运行时添加–reorder来尝试解决。以下提供了检查双端序列ID是否配对的比较代码

文件

i=C1
seqkit seq -n -i temp/qc/ i _ 1 _ k n e a d d a t a _ p a i r e d _ 1. f a s t q ∣ c u t − f 1 − d ′ / ′ ∣ h e a d > t e m p / h e a d e r _ {i}\_1\_kneaddata\_paired\_1.fastq|cut -f 1 -d '/' | head > temp/header\_ i_1_kneaddata_paired_1.fastq∣cut−f1−d′/′∣head>temp/header_{i}_1
seqkit seq -n -i temp/qc/ i _ 1 _ k n e a d d a t a _ p a i r e d _ 2. f a s t q ∣ c u t − f 1 − d ′ / ′ ∣ h e a d > t e m p / h e a d e r _ {i}\_1\_kneaddata\_paired\_2.fastq|cut -f 1 -d '/' | head > temp/header\_ i_1_kneaddata_paired_2.fastq∣cut−f1−d′/′∣head>temp/header_{i}_2
cmp temp/header_${i}_?

如果序列双端名称一致，且单样本质控结果异常时使用，适合旧版本：新版全kneaddata 1.12已经将此功能添加至流程，以下代码运行返倒引起错误

序列改名，解决NCBI SRA数据双端ID重名问题，详见《MPB：随机宏基因组测序数据质量控制和去宿主的分析流程和常见问题》。

以0.12.0为例，序列中间不一至存在:1和:2会无结果，

@A01909:80:HFT7YDSX5:2:1101:1289:1000 1:N:0:ATGAATAT+TTAAGTGG
@A01909:80:HFT7YDSX5:2:1101:1289:1000 2:N:0:ATGAATAT+TTAAGTGG

以0.12.0为例，最终的结果为无空格，结果/1和/2

@A01909:80:HFT7YDSX5:2:1101:1289:1000.1:N:0:ATGAATAT+TTAAGTGG/1
@A01909:80:HFT7YDSX5:2:1101:1289:1000.1:N:0:ATGAATAT+TTAAGTGG/2

以单个样本修改

i=A01
sed -i '1~4 s/ 1:/.1:/;1~4 s/KaTeX parse error: Undefined control sequence: \/ at position 2: /\̲/̲1/' temp/qc/{i}_1.fastq
sed -i '1~4 s/ 2:/.1:/;1~4 s/KaTeX parse error: Undefined control sequence: \/ at position 2: /\̲/̲2/' temp/qc/{i}_2.fastq

批量修改

sed -i '1~4 s/ 1:/.1:/;1~4 s/KaTeX parse error: Undefined control sequence: \/ at position 2: /\̲/̲1/' temp/qc/{i}_1.fastq
sed -i '1~4 s/ 1:/.1:/;1~4 s/KaTeX parse error: Undefined control sequence: \/ at position 2: /\̲/̲1/' temp/qc/{i}_2.fastq

**Perl环境不匹配**

报错’perl binaries are mismatched’的解决

e=~/miniconda3/envs/meta
PERL5LIB= e / l i b / 5.26.2 : {e}/lib/5.26.2: e/lib/5.26.2:{e}/lib/5.26.2/x86_64-linux-thread-multi

**Java环境错误**

出现错误 Unrecognized option: -d64，为版本不匹配——重装Java运行环境解决：

conda install -c cyclus java-jdk

若出现错误 Error message returned from Trimmomatic :
Error: Invalid or corrupt jarfile ~/miniconda3/envs/kneaddata/share/trimmomatic/trimmomatic；找不到程序，修改配置文件指定脚本名称

sed -i ‘s/trimmomatic\*/trimmomatic.jar/’ ~/miniconda3/envs/kneaddata/lib/python3.10/site-packages/kneaddata/config.py

**Python环境不匹配-找不到包module**

ModuleNotFoundError: No module named ‘importlib.metadata’

找不到包，一般是环境变量错误，先确定是否正常启动conda环境，没有重复启动 conda activate kneaddata。已启动检测环境变量

echo $PATH

/public/software/env01/bin:/public/home/liuyongxin/miniconda3/envs/kneaddata/bin:/public/home/liuyongxin/miniconda3/condabin:/usr/local/bin:/usr/bin:/usr/local/sbin:/usr/sbin

确认conda环境是否为第一个路径，此处kneaddata路径前还有更高优先级的目录在前，重设PATH变量，即删除当前conda环境前的所有路径

PATH=/public/home/liuyongxin/miniconda3/envs/kneaddata/bin:/public/home/liuyongxin/miniconda3/condabin:/usr/local/bin:/usr/bin:/usr/local/sbin:/usr/sbin

HUMANN物种功能定量

**metaphlan_to_stamp.pl**

如果出现下面的错误：

bash: /db/EasyMicrobiome/script/metaphlan_to_stamp.pl: /usr/bin/perl^M: 解释器错误: 没有那个文件或目录

sed -i ‘s/\r//’ ${db}/EasyMicrobiome/script/*.pl

**GraPhlAn图**

metaphlan2 to graphlan

export2graphlan.py --skip_rows 1,2 -i result/metaphlan2/taxonomy.tsv \
  --tree temp/merged_abundance.tree.txt \
  --annotation temp/merged_abundance.annot.txt \
  --most_abundant 1000 --abundance_threshold 20 --least_biomarkers 10 \
  --annotations 3,4 --external_annotations 7

参数说明见PPT，或运行 export2graphlan.py --help

graphlan annotation

graphlan_annotate.py --annot temp/merged_abundance.annot.txt \
  temp/merged_abundance.tree.txt  temp/merged_abundance.xml

output PDF figure, annoat and legend

graphlan.py temp/merged_abundance.xml result/metaphlan2/graphlan.pdf \
  --external_legends

**LEfSe差异分析物种**

*   输入文件：物种丰度表result/metaphlan2/taxonomy.tsv
*   输入文件：样品分组信息 result/metadata.txt
*   中间文件：整合后用于LefSe分析的文件 result/metaphlan2/lefse.txt，这个文件可以提供给www.ehbio.com/ImageGP 用于在线LefSE分析
*   LefSe结果输出：result/metaphlan2/目录下lefse开头和feature开头的文件

前面演示数据仅有2个样本，无法进行差异比较。下面使用result12目录中由12个样本生成的结果表进行演示

设置结果目录，自己的数据使用result，演示用result12

result=result12

如果没有，请下载演示数据

wget -c http://www.imeta.science/db/EasyMetagenome/result12.zip

unzip result12.zip

准备输入文件，修改样本品为组名(可手动修改)

预览输出数据

head -n3 $result/metaphlan2/taxonomy.tsv

提取样本行，替换为每个样本一行，修改ID为SampleID

head -n1 $result/metaphlan2/taxonomy.tsv|tr ‘\t’ ‘\n’|sed ‘1 s/ID/SampleID/’ >temp/sampleid
head -n3 temp/sampleid

提取SampleID对应的分组Group(假设为metadata.txt中第二列$2)，替换换行\n为制表符\t，再把行末制表符\t替换回换行

awk ‘BEGIN{OFS=FS=“\t”}NR==FNR{a[$1]=$2}NR>FNR{print a[$1]}’ KaTeX parse error: Undefined control sequence: \n at position 39: …p/sampleid|tr '\̲n̲' '\t'|sed 's/\…/\n/’ >groupid
cat groupid

合并分组和数据(替换表头)

cat groupid <(tail -n+2 $result/metaphlan2/taxonomy.tsv) > $result/metaphlan2/lefse.txt
head -n3 $result/metaphlan2/lefse.txt

方法1. 推荐在线 https://www.bic.ac.cn/ImageGP/ 中LEfSe一键分析

方法2. LEfSe命令行分析

conda activate lefse
result=result12

格式转换为lefse内部格式

lefse-format_input.py $result/metaphlan2/lefse.txt \
  temp/input.in -c 1 -o 1000000

运行lefse(样本无重复、分组将报错)

run_lefse.py temp/input.in temp/input.res

绘制物种树注释差异

lefse-plot_cladogram.py temp/input.res \
  $result/metaphlan2/lefse_cladogram.pdf --format pdf

绘制所有差异features柱状图

lefse-plot_res.py temp/input.res \
  $result/metaphlan2/lefse_res.pdf --format pdf

绘制单个features柱状图

查看显著差异features，按丰度排序

grep -v ‘-’ temp/input.res | sort -k3,3n

手动选择指定feature绘图，如Firmicutes

lefse-plot_features.py -f one --format pdf \
  --feature_name “k__Bacteria.p__Firmicutes” \
  temp/input.in temp/input.res \
  $result/metaphlan2/lefse_Firmicutes.pdf

批量绘制所有差异features柱状图

lefse-plot_features.py -f diff \
  --archive none --format pdf \
  temp/input.in temp/input.res \
  $result/metaphlan2/lefse_

**HUMAnN2减少输入文件加速**

HUMAnN2是计算非常耗时的步骤，如果上百个10G+的样本，有时需要几周至几月的分析。以下介绍两种快速完成分析，而且结果变化不大的方法。替换下面for循环为原文中的“双端合并为单个文件”部分代码

方法1. 软件分析不考虑双端信息，只用一端可获得相近结果，且速度提高1倍。链接质控结果左端高质量至合并目录

for i in tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1;do 
  ln -sf pwd/temp/hr/ i _ 1. f a s t q t e m p / c o n c a t / {i}\_1.fastq temp/concat/ i_1.fastqtemp/concat/{i}.fq
done

方法2. 控制标准样比对时间。测序数据量通常为650G，同一样本分析时间可达10h100h，严重浪费时间而浪费硬盘空间。
可用head对单端分析截取20M序列，即3G，则为80M行

for i in tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1;do 
   head -n80000000 temp/qc/ i _ 1 _ k n e a d d a t a _ p a i r e d _ 1. f a s t q   > t e m p / c o n c a t / {i}\_1\_kneaddata\_paired\_1.fastq  > temp/concat/ i_1_kneaddata_paired_1.fastq >temp/concat/{i}.fq
done

**metaphlan2无法找到数据库**

正常在首次运行时，会自动下载数据库。有时会失败，解决方法：

方法1. 使用软件安装的用户运行一下程序即可下载成功

方法2. 将我们预下载好的数据索引文件，链接到软件安装目录

db=~/db
soft=~/miniconda3
mkdir -p ${soft}/bin/db_v20
ln -s ${db}/metaphlan2/* ${soft}/bin/db_v20/
mkdir -p ${soft}/bin/databases
ln -s ${db}/metaphlan2/* ${soft}/bin/databases/

**CRITICAL ERROR: Can not call software version for bowtie2**

解决问题思路：

查看文件位置是否处在conda环境中：type bowtie2。如果不在需要手动设置环境变量的顺序，如果位置正确如在(~/miniconda2/envs/humann2/bin/bowtie2)，请往下看；

检测bowtie2运行情况：bowtie2 -h，报错wd.c: loadable library and perl binaries are mismatched (got handshake key 0xde00080, needed 0xed00080)。 错误原因为Perl库版本错误，检查Perl库位置：echo $PERL5LIB，错误原因没有指向环境，并手动修改perl库位置

设置你环境变量位置，最好用绝对路径

e=~/miniconda2/envs/humann2
PERL5LIB= e / l i b / 5.26.2 : {e}/lib/5.26.2: e/lib/5.26.2:{e}/lib/5.26.2/x86_64-linux-thread-multi

**metaphlan_hclust_heatmap.py报错AttributeError: Unknown property axisbg**

在网上搜索，axisbg和axis_bgcolor为过时的函数，新版为facecolor，修改为新名称即可 (参考：https://blog.csdn.net/qq\_41185868/article/details/81842971)

定位文件绝对路径

file=type metaphlan\_hclust\_heatmap.py|cut -f 2 -d '('|sed 's/)//'

替换函数名称为新版

sed -i ‘s/axisbg/facecolor/g’ $file

**metaphlan2-共有或特有物种网络图**

awk ‘BEGIN{OFS=FS=“\t”}{if(FNR1) {for(i=9;i<=NF;i++) a[i]=KaTeX parse error: Undefined control sequence: \tGroup at position 14: i; print "Tax\̲t̲G̲r̲o̲u̲p̲"} \    else…i>0.05) print “Tax_“FNR, a[i];}}’ \
   result/metaphlan2/taxonomy.spf > result/metaphlan2/taxonomy_highabundance.tsv
   
awk 'BEGIN{OFS=FS=”\t”}{if(FNR1) {print “Tax\tGrpcombine”;} else a[$1]=a[$1]==“”?$2:a[$1]$2;}END{for(i in a) print i,a[i]}’ \
   result/metaphlan2/taxonomy_highabundance.tsv > result/metaphlan2/taxonomy_group.tsv

cut -f 2 result/metaphlan2/taxonomy_group.tsv | tail -n +2 | sort -u >group

for i in cat group; do printf “#%02x%02x%02x\n” $((RANDOM%256)) $((RANDOM%256)) $((RANDOM%256)); done >colorcode

paste group colorcode >group_colorcode

awk ‘BEGIN{OFS=FS=“\t”}ARGIND1{a[$1]=$2;}ARGIND2{if(FNR==1) {print $0, “Grpcombinecolor”} else print $0,a[$2]}’ \
   group_colorcode result/metaphlan2/taxonomy_group.tsv > result/metaphlan2/taxonomy_group2.tsv

awk ‘BEGIN{OFS=FS=“\t”}{if(FNR==1) {print “Tax”,$1,$2,$3,$4, $5, $6, $7, $8 } else print "Tax_"FNR, $1,$2,$3,$4, $5,$6, $7, $8}’ \
   result/metaphlan2/taxonomy.spf > result/metaphlan2/taxonomy_anno.tsv

生物标志鉴定LEfSe

**lefse-plot_cladogram.py：Unknown property axis_bgcolor**

若出现错误 Unknown property axis\_bgcolor，则修改lefse-plot\_cladogram.py里的ax\_bgcolor替换成facecolor即可。

查看脚本位置，然后使用RStudio或Vim修改

type lefse-plot_cladogram.py

物种分类Kraken2

**合并样本为表格combine_mpa.py**

krakentools中combine_mpa.py，需手动安装脚本，且结果还需调整样本名

combine_mpa.py \
  -i tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1|sed 's/^/temp\/kraken2\//;s/$/.mpa/'|tr '\n' ' ' \
  -o temp/kraken2/combined_mpa

**序列筛选/去宿主extract_kraken_reads.py**

提取非植物33090和动物(人)33208序列、选择细菌2和古菌2157

mkdir -p temp/kraken2_qc
parallel -j 3 \
  “/db/script/extract_kraken_reads.py \
  -k temp/kraken2/{1}.output \
  -r temp/kraken2/{1}.report \
  -1 temp/qc/{1}_1_kneaddata_paired_1.fastq \
  -2 temp/qc/{1}_1_kneaddata_paired_2.fastq \
  -t 33090 33208 --include-children --exclude \
  --max 20000000 --fastq-output \
  -o temp/kraken2_qc/{1}_1.fq \
  -o2 temp/kraken2_qc/{1}_2.fq” \
  ::: tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1

组装Megahit

**序列长度筛选**

megahit默认>200，可选 > 500 / 1000 bp，并统计前后变化；如此处筛选 > 500 bp，序列从15万变为3.5万条，总长度从7M下降到3M

mv temp/megahit/final.contigs.fa temp/megahit/raw.contigs.fa
seqkit seq -m 500 temp/megahit/raw.contigs.fa > temp/megahit/final.contigs.fa
seqkit stat temp/megahit/raw.contigs.fa
seqkit stat temp/megahit/final.contigs.fa

**数据太大导致程序中断**

报错信息：126 - Too many vertices in the unitig graph (8403694648 >= 4294967294), you may increase the kmer size to remove tons

解决方法：需要增加k-mer，如最小k-mer改为29，不行继续增加或将数据分批次组装

添加参数： --k-min 29 --k-max 141 --k-step 20

二三代混合组装

**metaspades**

3G数据，耗时3h

i=SampleA
time metaspades.py -t 48 -m 500 \
  -1 seq/ i _ 1. f a s t q − 2 s e q / {i}\_1.fastq -2 seq/ i_1.fastq−2seq/{i}L_2.fastq \
  --nanopore seq/ i . f a s t q    − o t e m p / m e t a s p a d e s _ {i}.fastq \   -o temp/metaspades\_ i.fastq  −otemp/metaspades_{i}

**二三代混合组装OPERA-MS**

结果卡在第9步polishing，可添加–no-polishing参数跳过此步；短序列只支持成对文件，多个文件需要cat合并

perl …/OPERA-MS.pl \
    --short-read1 R1.fastq.gz \
    --short-read2 R2.fastq.gz \
    --long-read long_read.fastq \
    --no-ref-clustering \
    --num-processors 32 \
    --out-dir RESULTS

**二代组装+三代优化**

perl ~/soft/OPERA-MS/OPERA-MS.pl \
    --contig-file temp/megahit/final.contigs.fa \
    --short-read1 R1.fastq.gz \
    --short-read2 R2.fastq.gz \
    --long-read long_read.fastq \
    --num-processors 32 \
    --no-ref-clustering \
    --no-strain-clustering \
    --no-polishing \
    --out-dir temp/opera

结果可用quast或seqkit stat统计对二代组装的改进效果

基因序列prodigal

**序列拆分并行预测基因**

(可选)以上注释大约1小时完成1M个基因的预测。加速可将contigs拆分，并行基因预测后再合并。

拆分contigs，按1M条每个文件

n=10000
seqkit split result/megahit/final.contigs.fa -s $n

生成拆分文件序列列表

ls result/megahit/final.contigs.fa.split/final.contigs.part_*.fa|cut -f 2 -d ‘_’|cut -f 1 -d ‘.’ \
  > temp/split.list

9线程并行基因预测，此步只用单线程且读写强度不大

time parallel -j 9 \
  "prodigal -i result/megahit/final.contigs.fa.split/final.contigs.part_{}.fa \
  -d temp/gene{}.fa  \
  -o temp/gene{}.gff -p meta -f gff \
  > temp/gene{}.log 2>&1 " \
  ::: cat temp/split.list

合并预测基因和gff注释文件

cat temp/gene*.fa > temp/prodigal/gene.fa
cat temp/gene*.gff > temp/prodigal/gene.gff

基因去冗余cd-hit

**两批基因合并cd-hit-est-2d**

cd-hit-est-2d 两批次构建非冗余基因集

A和B基因集，分别有M和N个非冗余基因，两批数据合并后用cd-hit-est去冗余，计算量是(M + N) X (M + N -1)

cd-hit-est-2d比较，只有M X N的计算量

计算B中特有的基因

cd-hit-est-2d -i A.fa -i2 B.fa -o B.uni.fa \
    -aS 0.9 -c 0.95 -G 0 -g 0 \
    -T 96 -M 0 -d 0

合并为非冗余基因集

cat A.fa B.uni.fa > NR.fa

**cd-hit合并多批基因salmon索引时提示ID重复**

[error] In FixFasta, two references with the same name but different sequences: k141_2390219_1. We require that all input records have a unique name up to the first whitespace (or user-provided separator) character.

错误解决

mv temp/NRgene/gene.fa temp/NRgene/gene.fa.bak

15G,2m,4G

seqkit rename temp/NRgene/gene.fa.bak -o temp/NRgene/gene.fa

基因定量salmon

**找不到库文件liblzma.so.0**

*   报错信息：error while loading shared libraries: liblzma.so.0
*   问题描述：直接运行salmon报告，显示找不到lib库，
*   解决方法：可使用程序完整路径解决问题，alias salmon="${soft}/envs/metagenome\_env/share/salmon/bin/salmon"

基因功能数据库

**综合功能注释KEGG描述整理**

脚本位于 /db/script 目录，https://www.kegg.jp/kegg-bin/show\_brite?ko00001.keg 下载htext，即为最新输入文件 ko00001.keg

kegg_ko00001_htext2tsv.pl -i ko00001.keg -o ko00001.tsv

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