SEM拍摄-CSDN博客

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전자주사현미경(SEM, Scanning Electron Microscope) 是一种扫描电子显微镜，用来观察样品表面的微观结构和形貌。跟普通光学显微镜不同，它不是用光线而是用电子束来扫描样品，具有高分辨率和高放大倍数，可以看到纳米级的细节。

简单来说，它是这样工作的：

电子枪发射电子束，对样品表面进行扫描。
当电子束打到样品上时，会激发出各种信号（比如次级电子、背散射电子等）。
这些信号被探测器接收后，形成图像。
最终在屏幕上显示出样品表面的三维感图像。

SEM的优点：

放大倍数高（可达几万甚至几十万倍）
分辨率高
可观察表面细节、颗粒、断面、孔隙等
可用于材料学、生物学、半导体、医学等各个领域

需要注意的是：

样品通常需要导电（非导电样品需先喷金或碳）
需要在真空环境中观察

一句话解释：

SEM 是一种能让我们用“电子”而不是“光”来看样品表面的超高倍显微镜。可以看到非常非常细的结构，比如细胞表面、细菌的形状、微小颗粒等。

开始前的一些计算和整理：

99.8%酒精的配比方法

使用10 mL 蒸馏水，想用 99.8% 的酒精配制成 10% 浓度的酒精溶液，计算需要加多少 mL 的酒精。

步骤一：确定目标浓度和总体积

配成：

浓度：10%（v/v）
总液体体积 = 酒精体积 + 蒸馏水体积 = x + 10（mL）

设需要加入酒精体积为 x mL。

步骤二：浓度公式

浓度为体积百分比时使用：酒精体积 × 酒精纯度=目标浓度 × 总体积\text{酒精体积 × 酒精纯度} = \text{目标浓度 × 总体积}

代入数据： x×0.998=0.10×(x+10)x \times 0.998 = 0.10 \times (x + 10)

步骤三：解方程

0.998x=0.10x+10.998x = 0.10x + 1 0.998x−0.10x=10.998x - 0.10x = 1 0.898x=10.898x = 1 x≈1.1136 mLx ≈ 1.1136 \text{ mL}

答案：

你需要加入约 1.11 mL 的 99.8% 酒精 到 10 mL 蒸馏水中，才能配制出 10% v/v 的酒精溶液。

100%的酒精

但是99.8%的酒精基本可以当成100%的酒精，同理调制成 10% 的酒精溶液，这时我们来算：

你要用 100% 酒精（体积分数）配成 10% 的酒精溶液（v/v）
你有酒精，想知道要加多少蒸馏水
设你使用 1 mL 酒精

公式：

酒精体积÷目标浓度=总溶液体积\text{酒精体积} ÷ \text{目标浓度} = \text{总溶液体积} 1 mL÷0.10=10 mL1 \, \text{mL} ÷ 0.10 = 10 \, \text{mL}

所以：

总体积需要是 10 mL
已有 1 mL 酒精
需要加的蒸馏水 = 10 - 1 = 9 mL

酒精体积	加水体积	最终浓度
1 mL	9 mL	10%
2 mL	18 mL	10%
5 mL	45 mL	10%

我们可以根据你有多少酒精，成倍放大比例。

同理，把PBS也要进行稀释。

PBS是什么？

PBS 是 磷酸盐缓冲液（Phosphate-Buffered Saline）的缩写，是实验室里非常常用的一种生物缓冲液。

保持细胞外环境的 pH 稳定（通常是 pH 7.4，接近生理环境）
给细胞提供离子平衡环境，类似体液
冲洗样品（比如洗细胞、洗线虫）
溶解试剂、稀释样品

PBS 的主要成分：

成分	功能
NaCl（氯化钠）	维持渗透压
KCl（氯化钾）	提供钾离子
Na₂HPO₄（磷酸二氢钠）	缓冲剂
KH₂PO₄（磷酸一氢钾）	缓冲剂

有些 PBS 还会加钙镁（叫 PBS++），适合做细胞粘附实验。

PBS 的常见用途举例：

洗细胞（cell washing）
悬浮线虫（比如 C. elegans）
稀释抗体
稀释染色液
作为缓冲体系用于 ELISA、Western blot 等实验

小提醒：

PBS 是无菌、无毒的，但不含营养物质，不能长时间培养细胞或生物。它只是一个“干净的中性环境”。

sem拍摄过程

讲完这些后我们，了解一下SEM拍摄：就是使用扫描电子显微镜（SEM, Scanning Electron Microscope）对样品进行高倍放大、拍照观察其表面结构的过程。

通俗点说：

你可以把 SEM 想象成一个超级强的“相机”，但它不是用光线拍照，而是用电子束“扫描”样品，然后生成非常清晰的黑白图像。

SEM拍摄的过程一般包括：

1. 样品准备（特别关键）：

固定样品（用戊二醛或其他固定液）
脱水（通常使用酒精梯度脱水）
干燥（比如临界点干燥）
喷金或喷碳（在样品表面喷一层导电金属膜，让电子束能顺利扫描）

2. 安装样品：

把处理好的样品放在 SEM 样品托上，用导电胶贴好。

3. 放入 SEM 仪器：

样品被放入真空腔中。

4. 设置参数并拍摄：

设置加速电压、放大倍数、对焦等。
使用电子束扫描样品，仪器会生成图像。
然后可以保存图像（拍摄），用于论文、分析等。

SEM拍摄能看到什么？

细胞表面结构（比如微绒毛、孔洞）
细菌、病毒、线虫的外部形态
材料的表面（比如裂纹、颗粒、膜层）
金属、矿物、纳米材料的微观形态

图像特点：

黑白图像（灰阶）
分辨率极高（可以看到纳米级别结构）
有立体感和层次感

举个例子：

如果你用 SEM 拍 C. elegans（线虫），你可以看到：

它的嘴巴、肛门、刷毛
表面的纹理
是否有结构异常（比如突变体）

SEM拍摄的过程样品准备（特别关键）：

SEM 拍摄中，样品准备是最重要的步骤之一，尤其是生物样品（比如细胞、线虫、组织等），如果准备不好，图像就会糊、变形或者带静电。

SEM 样品准备步骤（以生物样品为例）

1. 固定（Fixation）

目的： 保持样品的原始结构，防止分解。

使用戊二醛（glutaraldehyde）（常用浓度：2.5%）
在 PBS 缓冲液中配置
固定时间：2–4 小时或过夜（4°C 更好）
固定完后用 PBS 洗几次（去掉残留戊二醛）

例子：将线虫浸泡在2.5% 戊二醛 + PBS中 4小时，然后用PBS洗3次，每次10分钟。

2. 后固定（可选，用于增强结构）

一般用于： 特别需要结构清晰的样品（如线虫口器、细胞膜等）

用 1% 四氧化锇（OsO₄） 固定
时间短（30分钟~1小时）
注意：四氧化锇有毒，要在通风橱操作！

3. 脱水（Dehydration）

目的： 除去水分，因为 SEM 要在真空下工作，不能含水。

使用不同浓度的乙醇（酒精）脱水：

浓度	时间
30%	10分钟
50%	10分钟
70%	10分钟
90%	10分钟
100%	10分钟 × 2次（更彻底）

每一步都用移液器轻轻转移，避免扰动样品。

4. 干燥（Critical Point Drying or Air Drying）

干燥方法有两种：

临界点干燥（Critical Point Drying）：效果最好，能保持样品原貌（推荐）
自然干燥（Air drying）：简便，但有可能样品会塌陷、变形（小心使用）

5. 喷金（Sputter Coating）

目的： 给样品表面喷一层金属（如金、铂），使其导电，避免图像出现充电或白点。

喷金设备叫 sputter coater
喷金厚度：一般几纳米
喷金时间：几十秒~几分钟（根据样品调整）

注意：喷金越薄，分辨率越高；越厚，导电性越好，但可能遮盖细节。

6. 上样 & 拍摄

把处理好的样品粘在 SEM 样品托盘上（用导电胶或碳胶）
固定好以后放进 SEM 仪器
抽真空、调整参数、拍图

总结一下（生物样品 SEM 简易流程）：

固定 →（后固定）→ 脱水 → 干燥 → 喷金 → 上机观察

（这是一份完成的过程与方案）如果想详细的讲解固定和脱水

一、固定（Fixation）

1. 为什么要固定？

保持样品原始的生物结构
防止酶解、自溶或细胞破裂
防止 SEM 拍的时候结构“垮塌”或“流失”

2. 常见固定剂（但你现在没有戊二醛，就跳过它）

固定剂	用途	特点
戊二醛 (Glutaraldehyde)	一级固定	交联蛋白质，保持细胞结构
四氧化锇 (OsO₄)	二级固定	固定脂类，增强结构清晰度
酒精（乙醇）	替代方案	不能真正“固定”，但可以脱水，部分固定效果

3. 如果没有戊二醛怎么办？

就只能用酒精“简化替代”固定过程了 —— 虽然不是最优方案，但可以在预观察、教学或资源有限条件下使用。

你可以直接从30%酒精开始，慢慢替代样品中的水分，并起到部分结构稳定作用。

二、脱水（Dehydration）

1. 为什么要脱水？

电子显微镜必须在真空中操作
生物样品里大部分都是水，如果不脱水会：
- 样品变形
- 爆裂或汽化
- 影响真空环境，设备也可能受损

2. 脱水的正确方法：

不能一下子放进 100% 酒精，会让样品立刻变形！必须渐进式脱水。

3. 酒精梯度脱水法（标准流程）：

步骤	酒精浓度	时间	说明
1	30%	10 min	温和开始脱水
2	50%	10 min	开始中度脱水
3	70%	10 min	脱掉大部分水分
4	90%	10 min	基本无水环境
5	100%	10 min × 2次	完全脱水，做准备进入干燥阶段

每一步都要轻柔换液，避免扰动样品。
如果样品小（如线虫），可以用小离心管+微量离心再换液。
切记：不要跳步！逐级升浓度是关键。

4. 小技巧：

换液时动作轻：用吸管慢慢吸走上层液体，不要碰到样品。
保留最后一次 100% 酒精液备用：用于转移样品到干燥或喷金前的状态。

三、接下来的步骤（简提一下）

如果你已经完成了酒精脱水，下一步是：

干燥（可以是风干或临界点干燥）
喷金
上机观察

因为我的实验中使用到HMDS,我将来介绍这是什么

HMDS 是指 六甲基二硅胺烷（Hexamethyldisilazane），在生物样品做 SEM（扫描电子显微镜）前的准备中，它是一种常用的 替代干燥剂。

HMDS 是干嘛用的？

在 SEM 样品制备中，HMDS 可以用来 替代临界点干燥（CPD），起到温和脱水和干燥样品的作用。

它的功能是：

脱去样品中的酒精
在样品表面留下保护性硅膜
防止样品塌陷或变形
提高 SEM 成像质量

HMDS 干燥流程（用于生物样品，比如细胞、线虫）

这是在完成 酒精脱水（100%酒精 × 2次）之后进行的。

简易流程如下：

步骤	操作内容	时间
1	用 1:1 的 HMDS：100%酒精混合液处理样品	5~10 分钟
2	再换成 100% HMDS 处理样品	5~10 分钟
3	将样品移出，自然挥发干燥（风干）	数小时或过夜