AbMole| BS3助力揭秘衣康酸转运体ABCG2抑制免疫抗菌能力

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来自中国科学院生物物理研究所的Chao Chen和Xinjian Li 等多名研究人员在Cell Metab期刊（IF=29）上，发表了题为“ABCG2 is an itaconate exporter that limits antibacterial innate immunity by alleviating TFEB-dependent lysosomal biogenesis”的研究成果，该研究使用了购自AbMole的Bis(sulfosuccinimidyl) suberate(BS3，M9872)，并揭示了ATP 结合盒转运体 G2（ABCG2）是一种衣康酸转运体，能将衣康酸转运到细胞外，从而抑制衣康酸诱导的TFEB活化和溶酶体生成，最终抑制先天免疫抗菌防御能力。

衣康酸是一种由免疫应答基因1(IRG1)对TCA循环中间产物顺乌头酸进行脱羧而合成的代谢产物，随后被转运到细胞质中，从而在巨噬细胞中发挥多种调节作用。然而，衣康酸从巨噬细胞中排出的机制仍不清楚。

研究人员通过构建gRNA 文库进行CRISPR-Cas9 筛选，并在筛选的结果中，将 ABCG2 作为潜在的衣康酸输出体进行进一步研究。

随后研究人员敲除了THP-1 细胞和永生化小鼠骨髓衍生巨噬细胞（iBMDMs）中的 ABCG2/Abcg2。免疫印迹和生化分析结果表明，在 LPS 刺激下，ABCG2/Abcg2 基因敲除（KO）不会改变IRG1的水平，但是细胞内衣康酸水平升高，而培养上清液中的衣康酸水平下降，提示 ABCG2 能促进衣康酸从 LPS 激活的巨噬细胞中输出。

接下来通过引入点突变，削弱 ABCG2 介导的 ATP 水解活性。生化分析表明ABCG2 ATP水解缺失突变体的重组表达能导致细胞内衣康酸水平升高，培养上清液中衣康酸水平下降。然后研究人员通过测定野生型和ATP 水解缺陷突变体在脂质体中重组后的体外ATP酶和衣康酸转运活性，发现 ABCG2 的转运活性依赖于水解ATP。

之前的研究发现，衣康酸能通过激活转录因子 TFEB诱导溶酶体生成。在本研究中，免疫荧光和细胞分馏分析等实验结果表明，ABCG2/Abcg2 KO或 ABCG2 ATP水解缺陷突变体的重组表达能促进 LPS 刺激的TFEB 核易位，促进溶酶体基因表达和溶酶体区室的形成。

此外，免疫印迹分析和ELISA结果表明，ABCG2/Abcg2的缺失，在LPS刺激下会升高NRF2和ATF3的蛋白水平，抑制IL-1b 分泌。同时，ASC寡聚化试验也表明，ABCG2/Abcg2缺失会导致大型多聚 ASC 复合物减少，提示ABCG2 缺乏能促进衣康酸诱导的溶酶体生物生成，并抑制巨噬细胞的炎症程序激活。 

随后，研究人员用鼠伤寒沙门菌（S. typhimurium）感染 THP-1 细胞和 iBMDMs，并发现鼠伤寒沙门菌感染能以 ABCG2 依赖性方式诱导 IRG1 表达，并且BCG2/Abcg2 KO 或 ABCG2 ATP水解缺陷突变体的重组表达会导致细菌滴度下降，提示ABCG2 是巨噬细胞先天免疫抗菌防御的有效负调控因子。

接下来，研究人员构建了髓细胞特异性Abcg2-KO小鼠模型，并采用鼠伤寒沙门菌感染小鼠模型进一步进行体内实验。结果表明，ABCG2 的缺失会以 IRG1 依赖性的方式促进体内的先天免疫抗菌防御。

最后，为了确定该研究结果与人类的相关性，研究人员使用人巨噬细胞进行验证，生化分析和亚细胞分馏分析等研究表明，在 LPS 激活的人巨噬细胞中，ABCG2 的表达与衣康酸的输出相关，阻断 ABCG2 可促进 TFEB 激活和 TFEB 依赖性溶酶体生物生成。

本研究使用了购自AbMole的Bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3，M9872)，BS3是一种活性交联剂，常用于蛋白质、多肽和细胞表面的交联反应中。它可以通过酰胺键结合到含有羟基、胺基或硫代基的官能团上，从而实现目标物的交联。研究人员使用BS3交联样品检测 ASC 的寡聚化，从而得到了ABCG2/Abcg2缺失能导致大型多聚 ASC 复合物减少，并抑制巨噬细胞的炎症程序激活的结论。

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