cart细胞高效制备流程

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《快速生产CAR-T细胞新方案》

G-REX是美国Wilson Wolf Manufacturing 为T细胞免疫疗法研发的一款用于T细胞培养的装置，克服了目前T细胞免疫治疗大规模应用的障碍。G-REX培养瓶通过底透气膜使O2和CO2得到充分交换，一次性加入大量培养基可支持细胞培养长时间不换液，减少换液频率，减少操作，并且细胞培养过程中不需要摇晃，在普通的CO2培养箱中静止培养即可。目前已被证实在培养：CTL，TIL ，NK， Vg9Vd2 T cells ，调节性T细胞，病毒特异性T细胞。

 

目前，T细胞转导基因是细胞治疗流程的障碍之一。普遍的细胞转导步骤是将激活的T细胞在涂有RetroNectin的袋子或板上进行病毒转导，在这个过程中其中要先预处理涂有RetroNectin的袋子或板子，然后才能进行转导。转导后还要更换新的培养容器。这种方法虽然转导效率相对比较好，但步骤繁琐，花费时间长，而且不符合封闭操作。

 

G-REX培养瓶不能包被RetroNectin，所以导致细胞转导无法在G-REX瓶子中完成。

 

Vectofusin-1 (MiltenyiBiotec Inc., Auburn, CA, USA)是一种合成肽，当加入到病毒和细胞的溶液中时，可以增强病毒转导。Vectofusin-1形成a-螺旋状纳米纤维，与病毒颗粒结合增强病毒-细胞相互作用。

 

在这里，我们分享一种简单的方法，用于在悬浮液中转导T细胞，并且作者展示了新的转导步骤，集成到一个流线型的制造过程，而整个过程仅仅依赖于一个单一的G-Rex生物反应器。（Christine Gagliardi, Mariam Khall & Aaron E Foster, Streamlined production of genetically modified T cells with activation, transduction and expansion in closed-system G-Rex bioreactors,Cytotherapy,2019;21:1246-1257） 

首先，作者对传统的转导病毒培养模式和G-REX培养模式做了流程的对比

 

基于培养袋和G-REX的流程

 

可以看出，用G-REX和Vectofusin-1，可以简化步骤，使得使细胞激活，转导，扩增，收获都在同一个G-REX瓶子中完成。

G-REX培养实验步骤如下

在封闭系统G-REX100M-CS中

Day 0 ：PBMC在40ML培养基中复苏，激活

Day 2：转导，将Vectofusin-1和病毒液加到G-REX100M-CS中

Day 3：培养基加到最大体积（1L）

之后每天取上清液，检测葡萄糖浓度和乳酸盐浓度。每三天添加一次细胞因子。

Day11：收获细胞（GatheRex）

作者对两种培养模式下的细胞数目做了对比，可以看到细胞数在第14天左右达到最大，而且在相同接种数下，培养袋和G-REX培养的细胞数目几乎没有差别。

 

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细胞数对比

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扩增倍数对比

 

培养同样天数的情况下，需要操作的时间对比。

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时间对比

 

可以明显看出G-REX培养在操作的时间上比传统操作节省75%的时间。

 

同时，也对整个实验流程所用到的实验耗材做了价格上的对比，可以看出用G-REX培养节省了38%的费用。

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价格对比

当然，作者还对两种培养方式下，收获的T细胞的表型和功能进行分析，实验数据表面并无差异，详情见文章。

 

本篇文章介绍了在G-REX瓶子中完成T细胞激活、转导、扩增、收获等步骤，虽然转导效率比传统转导方式略低，但在操作时间，费用等方面节省很多，而且消除了细胞在激活和转导之间的清洗和转移，降低了操作步骤，减少了污染的风险。而且也附和我国颁布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》中，提出的细胞治疗研究者应不断优化制备工艺，减少物理、化学或生物学作用对细胞的特性产生非预期的影响，尽量达到自动化、全封闭的生产的标准。微信搜索“泽平科技”可咨询更多技术详情！