CRISPER实验介绍

一、实验流程介绍

天然的CRISPR-Cas9系统由三部分组成：SpCas9 (简称Cas9)、crRNA、tracrRNA。tracrRNA（在CRISPR-Cas9编辑技术中被优化并命名为gRNA scaffold），它负责与Cas9结合，与重复序列具有同源性。crRNA为引导序列，约20个碱基，具有特异性。其中，crRNA和tracrRNA通过局部碱基配对组合并与Cas9结合后，引导Cas9识别切割目标DNA序列 (图1)。为了方便实验设计以及提高gRNA的稳定性，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier将crRNA和tracrRNA融合成一条RNA链条，并把其称为sgRNA (single-guide RNA)。与 CRISPR-Cas9 系统不同的是 在CRISPR-Cas12a 系统中，Cas12a不需要tracrRNA，并且产生的断链为粘性切割，并识别富含T的PAM。在个别菌株编辑实验中，Cas12a比Cas9表现出较高的编辑效率，如谷氨酸棒杆菌，梭状芽孢杆菌。

图1

 

1. 目标菌株检测及培养

扩培目标菌株，耐药测试以确保菌株不携带用来进行阳性克隆筛选的抗性基因，目标基因测序即确定靶基因序列

2. gRNA序列筛选

根据脱靶效应得分和靶向活性参数，选择至少2个，理论上编辑效率较高 gRNA序列，通常约20个碱基。目前已有许多在线的gRNA 设计软件可用于计算gRNA的参数。

3. 确定同源修复模板长度和序列

同源臂的长度会影响DNA断链的修复效率，选择模版是最好与切割点控制在10 bp以内。在细菌中，常用的同源臂长度一般在50 – 80个碱基。

4. 非模式菌株启动子、复制起点筛选、合成