关于CRISPR基因编辑防脱靶、高效编辑的一种方法学评估

CRISPR是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats的缩写，中文意思为规律间隔成簇短回文重复序列。

在自然界中，CRISPR在细菌的免疫系统中起到非常重要的作用。当病毒入侵细菌时，细菌中的分子机制会将病毒的部分序列插入到CRISPR位点中。当病毒再次入侵时，CRISPR位点会进行转录和加工。加工后的CRISPR RNA会与Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物，对病毒的基因组进行“扫描”。当发现与CRISPR RNA互补配对的片段后便会结合，Cas蛋白会进行切割，以达到免疫的目的。

 

在许多基因组工程运用中，我们使用的是源于 Streptococcus pyogenes 的 Cas9 蛋白，CRISPR RNA则由人工合成的gRNA代替。gRNA与基因组目标位点的结合还同时取决于位于目标位点下游的一段前间隔序列邻近基序（PAM）的存在。其中，PAM 序列所在的 DNA 单链与 gRNA 所结合的 DNA 单链是两条不同的链。源于不同原核生物的 Cas 蛋白识别不同的 PAM 序列。我们最常用的 Cas9 蛋白识别的 PAM 序列是 5'-NGG-3'，其中 N 代表任意核苷酸。

如果 PAM 序列匹配正确，并且 gRNA 成功地与目标位点结合，那么 Cas9 会在 PAM 序列上游约 3-4 个核苷酸进行 DNA 双链的切割。

 

Alt-R™ CRISPR-Cas9 系统 -用于提高基因编辑效率

Alt-R CRISPR-Cas9系统包括成功进行基因组编辑所需的所有试剂。基于天然S. pyogenes CRISPR-Cas9系统，Alt-R CRISPER-Cas9系统与其他方法相比拥有更多的优势：

 

使用Alt-R S.p.Cas9 Nuclease 3NLS进行高效编辑

Alt-R CRISPR-Cas9系统包括高效的Alt-R S.p.Cas9 Nuclease 3NLS。通过将Alt-R S.p.Cas9 Nuclease 3NLS与优化的化学修饰Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA和tracrRNA结合形成一个RNP，该系统优于其他编辑方法（图1）。RNP转染允许对编辑复合体进行最佳剂量控制，并且不可再生的Cas9RNP可以在短时间内通过内源性机制被清除，有效地限制了脱靶编辑。

图1 优化的crRNA：tracrRNA优于其他guide RNA类型。

Alt-R™ CRISPR-Cas9 RNA、天然的S. pyogenes CRISPR RNA、体外转录（IVT）single-guide RNA（sgRNA）和通过表达质粒或gBlocks® 基因片段表达的sgRNA均靶向4个人类HPRT基因位点（38087 AS、38509 S、38285 AS和38636 AS）。将guide RNA转染到稳定表达Cas9的HEK-293-Cas9细胞中。使用T7EI测定法的突变检测显示，Alt-R CRISPR-Cas9RNA在大多数位点的表现优于其他guide RNA类型。

高效的性能可简化设计

Alt-R CRISPR-Cas9系统中优化的crRNA 和tracrRNA 优于其他CRISPR guide RNA形式（图2）。实际上,该系统非常高效,因此cr RNA需要最少的设计工作。唯一需要提供的是一个与您靶基因中的PAM（前间区序列邻近基序；NGG）序列紧邻的、具有位点特异性的19或20个碱基的序列。使用Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA,在标准条件下,平均>80%的靶序列将显示有效的编辑。

图2 针对STAT3基因中92个PAM位点设计的Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA提供了高效的编辑效率。

Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA（n=92），靶向STAT3基因座中的每个PAM位点。使用T7EI测定法的突变检测显示，93%的crRNA在HEK-293-Cas9细胞中表现出了良好至优异的性能，编辑效率>20%。注：T7EI不能检测单碱基缺失或插入，会使编辑效率被低估。

 

部分使用 IDT Alt-R® CRISPR 发表在 Nature、Neuron 等期刊上的文章：

Riddle MR, Aspiras AC, et al. (2018) Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature, 555 : 647–651.

Luo L, Bokil N, et al.. (2017) SCIMP is a transmembrane non-TIR TLR adaptor that promotes proinflammatory cytokine production from macrophages . Nat Commun, 8 : 14133.

Agudelo D, Duringer A, et al.. (2017) Marker-free coselection for CRISPR-driven genome editing in human cells. Nature Methods, 14 :615–620.

Mikheikin A, Olsen A, et al. (2017) DNA nanomapping using CRISPR-Cas9 as a programmable nanoparticle. Nat Commun, 8 : 1665.

Kohler S, Wojcik M, et al.. (2017) Superresolution microscopy reveals the three-dimensional organization of meiotic chromosome axes in intact Caenorhabditis elegans tissue . Proc Natl Acad Sci USA, 114 : E4734–E4743.

Seki A, Rutz S. (2018) Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. doi: 10.1084/jem.20171626

Quadros RM, Miura H, et al. (2017) Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins . Genome Biology, 18 : 92.

Han X, Liu Z, et al. (2017) Cas9 ribonucleoprotein delivery via microfluidic cell-deformation chip for human T-Cell genome editing and immunotherapy . Adv Biosys, 1 : 1600007.

Andersson M, Turesson H, et al. (2018) Genome editing in potato via CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein delivery. Physiol Plant. doi: 10.1111/ppl.12731

Brinkman EK, Kousholt AN, et al. (2018) Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Res. doi: 10.1093/nar/gky164

Kim KW, Tang NH, et al. (2018) A neuronal piRNA pathway inhibits axon regeneration in C. elegans. Neuron, 97 : 1–9.

Al Abdallah Q, Ge W, Fortwendel JR. (2017) A simple and universal system for gene manipulation in Aspergillus fumigatus: in vitro-assembled Cas9 guide RNA ribonucleoproteins coupled with microhomology repair templates. mSphere, 2 : e00446–17.

di Pietro F, Valon L, et al.. (2017) An RNAi screen in a novel model of oriented divisions identifies the actin-capping protein Z β as an essential regulator of spindle orientation. Curr Biol, 27 : 2452–2464.

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