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具体操作步骤如下:
1.无菌条件下取材(术中切除的全层软骨片),于含无血清的DMEM培养液的无菌容器中保存,低温下转移(冰盒),移入超净工作台,PBS冲洗3次。剪去非软骨组织如滑膜组织或纤维结缔组织。
2.收集全部软骨,移入50ml离心管中。用10mlPBS洗软骨组织碎块2-3遍。在离心管内再加入新鲜的0.25%的胰蛋白酶(10ml/g),37培养箱中消化30-45min(最好在搅伴状态下),以除去可能附着的成纤维细胞。加入等量的10%DMEM终止消化,吹打后去除胰蛋白酶和成纤维细胞,再各用10mlPBS清洗两遍。
3.将软骨移入培养皿,倒入PBS淹盖标本为止,用无菌刀片将软骨片切成1mm3大小的碎粒,移入第二个50ml离心管中,PBS淹盖,冲洗3次。(标本要稍多一点,至少大于300mg试验取1g左右,软骨块要尽量切碎,便于消化)
4.加入5ml的0.2%的II型胶原酶,37培养箱中消化4-6h,其中2h后每隔20min晃动离心管一次,观察软骨块基本被消化,悬液变混浊。(II型胶原酶消化4-6h见悬液变混浊,表明已有软骨细胞消化下来,可先收集,未消化完的的软骨碎粒可继续消化,0.1%的II型胶原酶过夜约18-24h)
5.120目滤器过滤收集悬液(用PBS冲洗滤器底和皿底尽可能收集所有细胞),彻底打匀成团的细胞。
6.1000r/min离心10min,弃上清液,PBS重悬3次,相同条件再离心,弃上清液去除胶原酶,收集细胞。
7.加入10%DMEM培养液1ml,吹打均匀后移入10cm培养皿中,补足培养液至10ml。(吹打后可行计数板计数及台盼兰活性检测,或以2.5x104/cm2的比例置于培养皿中。)
8.48h后首次换液去除未贴壁的细胞。
9.置于37 5%CO2培养箱内继续培养,每隔3-4d换液1次,倒置显微镜下观察拍照。
10.细胞长满近融合时用0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化2-3min,1200r/min离心5min,弃上清液,计数,按1:3或1:4传代。(推荐1:2传代)如果组织量多,可重复4-8步骤。