微血管内皮细胞培养方法

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Lonza UltraCULTURE 无血清培养基使用说明

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方法一：

步骤如下：

取体质量60 - 70g雄性SD 大鼠

无菌条件下取出大脑,

放入预冷DHank′s 中,

剥离软脑膜、大血管及大脑髓质,

收集大脑皮质, 剪碎成1mm3 的小块,

移入匀浆器中匀浆, 将匀浆液依次通过80 目和200 目尼龙网过滤,

收集200 目尼龙网上的微血管段。用0.12 %胶原酶37 ℃消化20min

。冲洗液冲洗2遍, 离心所得沉淀用配制的内皮细胞完全培悬浮后,

接种于明胶预先包被的培养瓶中, 37 ℃, 5 %CO2 培养箱中静置培养。

约6 - 7 天细胞基本融合成片后, 用01125 %胰蛋白酶+ 0102 %EDTA 消化, 进行传代。

 

方法二:

选用DMEM高糖培养基。
1.取5-7天大鼠心脏，用PBS洗净血液
2.用75%乙醇浸泡30s
3.用PBS冲洗后，剪碎，用适量0.5%胶原酶在37度摇摆水浴中消化30min，加入适量0.02%胰蛋白酶，用吸管轻轻吹打，37度水浴中消化30min。
4.分离下的细胞过200目筛网，过滤液用20%小牛血清DMEM培养基混悬离心（1000转/min，5min），未过网的弃之。
5.所得细胞悬于20%小牛血清DMEM培养基，并调整细胞浓度到104-105/ml，接种于0.2%明胶预处理的培养瓶中37度培养4小时，以去除未黏附细胞，更换含50mg/L肝素、10mg/L内皮细胞生长因子的DMEM完全培养基培养。 
6.每3-4天换液一次，直至长成细胞单层，选3-4代传代内皮细胞，0.25%胰蛋白酶消化备用。

 

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