【评测】重组C因子法内毒素检测技术解析

最新推荐文章于 2021-04-27 17:14:13 发布

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文章标签： C因子 C因子法内毒素检测鲎试剂替代

本文链接：https://blog.csdn.net/Bio12345/article/details/115194543

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Lonza PyroGeneTM重组C因子试剂盒是内毒素检测方法的发展成果。通过体外重组鲎凝血级联反应的第一个组分：C因子，重组C因子法只需一部反应，优于传统LAL法且不依赖动物源成分-鲎血。

PyroGeneTM重组C因子法，激活的C因子直接剪切一个荧光底物，产生的信号被荧光酶标仪识别。由于荧光信号的动态范围大，相较于传统的动态LAL法，PyroGeneTM重组C因子法只需一步反应，检测范围即可达到5.0EU/ml – 0.005 EU/ml。

▲ 上图分别展示了PyroGeneTM重组C因子与传统LAL法，如动态显色法和动态浊度法的激酶级联反应。

与经典的鲎试剂内毒素检查方法相比，重组C因子内毒素检测法具有更高的特异性，更好的专属性、精密度、准确度、线性范围及定量限，是目前鲎试剂内毒素检测方法的改良方法，具有以下优点：

内毒素特异性，重组技术消除了鲎试剂中β-1,3-葡聚糖对检测结果的干扰，导致潜在假阳性的产生
不依赖动物源性成分，提供更高的供应安全性
重组表达生产，产品批间一致性良好
终点荧光测定，与其他定量鲎试剂方法相当
灵敏度范围从0.005到5EU/ml
消除了对动物源试剂的依赖，符合3R的替代原则
药典推荐

可替代传统鲎试剂用于人用和动物用注射药物（如化学药品、放射性药物、抗生素类、生物制品等）及医疗器械（如透析液、植入式器械等）的原辅材料、中间产品、放行产品的内毒素检测。

重组C因子法合规审批历史

2012年6月，美国食品药品管理局(FDA)发布了“工业热原与内毒素检测的问答指南”文件，将重组C因子法作为LAL法的替代内毒素检测方法*。

2015年7月，欧洲药典在新起草的章节5.1.10中将重组C因子法作为LAL和家兔热源测试的替代内毒素检测方法*。

2016年7月1日，章节5.1.10正式生效。美国食品药品管理局(FDA)已经允许了510（K）使用PyroGeneTM重组C因子法进行内毒素放行检测的药物临床申请。

2018年9月，美国食品药品管理局(FDA)首次批准使用重组C因子法进行细菌内毒素放行检测的药物，一款用于治疗成人偏头痛的单抗药物。

2018年12月，欧洲药典起草了重组C因子法细菌内毒素检测的新章节2.6.32。

2019年1月，继欧洲药典(EP)、日本药典(JP)和美国药典(USP)之后，第4版本的中国药典将重组C因子法列为细菌内毒素检测方法，并将在2020年生效。

* 参见美国药典(USP)

Lonza rFC 产品

关于Lonza

LONZA（龙沙）集团是一家以生命科学为主导，总部位于瑞士，旗下20多家生产厂和研发中心遍布全球各地。龙沙是世界医药、保健及生命科学领域的领先供应商之一，其产品和服务满足客户从研发到终端产品制造的需求。截至2019年底，龙沙在全球拥有100多个生产基地和办事处以及约15,500名全职员工。2019 年，公司销售额达59亿瑞士法郎，核心业务的息税折旧摊销前利润（EBITDA）达16亿瑞士法郎。

关于Lonza内毒素检测试剂盒

关于推荐仪器：PyroWaveXM、SynergyHTX

试剂：

所有试剂，包括荧光溶质和检测用缓冲液，均必须无内毒素。必要时，根据测试盒生产商的指示要求溶解试剂。试剂应根据生产商要求冷藏或冷冻条件下存贮。

BET用水（细菌内毒素检测用水）：

注射用水R或采用其它方法生产的水，在试剂检测限水平不会与试剂发生反应。

标准内毒素贮备液制备：

标准内毒素贮备液采用经过国际标准如内毒素标准BRP标定的内毒素标准品制备，内毒素单位为国际单位（IU），国际标准的IU等同性由WHO规定。遵照包装说明书和标签上的要求制备和存贮标准内毒素贮备液。

标准内毒素溶液制备：

剧烈混合标准内毒素贮备液，使用BET用水制备适当级别稀释液，溶液应尽快使用以避免活性因吸收而降低。

供试液制备：

用BET用水溶解或稀释原料药或制剂制备供试液。有些原料药和制剂可能需要溶解或解释在其它水性溶液中。必要时，调节供试液pH值（或稀释）使得试剂与供试液混合物的pH值在测试盒生产商所指定的pH范围内，通常为6.0-8.0。可根据测试盒生产商的建议使用酸碱或适当的缓冲液调整pH。酸碱可采用浓缩物或固体经BET用水在没有可检出内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证无可检出内毒素和干扰因子。

最大有效稀释度确定：

按照试剂盒或药典描述的方法进行确定。

荧光定量检测：

本实验是基于内毒素浓度和试剂混合物在孵育结束后的荧光之间的定量关系，表示为ΔRFU。

ΔRFU= RFUtend-point- RFUt0

RFUt0：孵育开始时试剂混合物荧光，对于所有的待测样品来讲，RFUt0应该是非常接近的，表明所有待测样品本底信号是均匀一致的，没有其他因素的干扰。

RFUtend-point：孵育结束时试剂混合物荧光

在检测盒生产商所建议的孵育温度进行检测（通常为37 ±0.5°C）。

预检测：

预检测是为了确保荧光技术有效性。此检测是为了证明满足标准典线的标准，并且供试液对检测无干扰。

标准曲线标准：

仪器灵敏度必须根据每批rFC或标准内毒素进行调整，其设置必须符合测试盒生产商的建议。使用标准内毒素溶液，在试剂盒生产商指定的浓度范围内制备至少3个内毒素浓度溶液，制作标准曲线。如果所需范围超出生产商所指定浓度范围的2个以10为底的浓度对数，则必须包括更多标准以覆盖范围内每个浓度对数增加值。按生产商建议（体积比、培养时长、温度、pH等），每个标准内毒素溶液至少配制3份重复检测。

在所制备的内毒素浓度范围内，相关系数绝对值|r|必须大于等于0.980。

干扰因子：

由于rFC试剂盒没有因子G，因此无法激活假阳性β-葡聚糖。在将本方法与其它细菌内毒素定量方法进行比较时必须考虑此情况。

选择等于或接近于内毒素标准曲线中间值的内毒素浓度。按下表要求配制溶液A、B、C和D。按检测合生产商要求每个溶液至少检测2次（供试液和测试试剂盒混合物体积，供试液与测试试剂盒混合物的体积比，培养时间等）。

溶液A=供试液，可稀释但不得超过MVD

溶液B=与溶液A相同稀释倍数配制后检测，添加了等于或接受标准曲线中间浓度内毒素

溶液C（阳性控制）=标准内毒素溶液

如果满足以下要求，则认为检验有效

溶液C制作的标准曲线的相关系数r绝对值大于等于0.980
溶液D所得结果不得超过所用试剂混合物描述所要求的空白限值，或低于所用rFC的内毒限检测限。
从添加了内毒素的溶液中（溶液B，上表）扣除溶液中平均内毒素浓度（如有）（溶液A，上表）计算平均回收率。
如果在检测条件下，供试液中添加内毒素后检出浓度扣除未添加前溶液中检出的内毒素后，为已知添加浓度的50-200%，则认为供试液没有干扰因子。

如果内毒素回收率超出指定范围，则认为供试液含有干扰因子。使用不超过MVD的更大稀释倍数重复检测。另外，供试液或稀释后供试液（未超过MVD）的干扰有可能通过执行适当的经验证的处理方法消除，例如，过滤、中和、渗析、热处理或内毒素专用绑定步骤（在没有干扰基底时，检测之前从供试液中富集内毒素）。为证明所选处理方法可有效消除干扰而不损失内毒素，应使用待检样品添加标准内毒素和进行所选处理的样品重复干扰因子测试。

检测程序

检测程序和预检测步骤基本是一样的，把需要的检测样品作为供试品即可。Lonza和Hyglos都有特别编写的程序，完成供试品在板上的分布后，直接运行即可。仪器会自动完成检测并给出检测分析结果。

RFUt0、RFUtend-point检测结果示意图