内毒素检测新方法！重组C因子法获全球监管机构认证

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《LONZA 龙沙 内毒素检测试剂盒说明书 》​​​​​​​

 

近期，欧洲药典委员会（Ph. Eur.）在第165届会议上宣布，计划在下一个版本的四个总章里涵括第2.6.32章，即使用重组C因子法进行细菌内毒素检测。该版本预计在2021年1月1日生效。这标志着重组C因子法（如lonza PyroGeneTM rFC Assay）首次被全球监管机构认证为药典细菌内毒素检测方法。我们期待更多的监管机构能正式通过这种全新、可持续的内毒素检测方法。

内毒素生活中处处可见

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖（LPS），是一种典型的热原。

 

内毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的黏肽上。各种细菌的内毒素的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克等。内毒素耐热而稳定，抗原性弱。

因为其有着耐热性和稳定性，通过高压蒸汽处理也不能完全使内毒素灭活，需在250℃或以上的温度下，干热处理至少半小时才能使其灭活。它存在于革兰氏阴性菌栖息的环境中（例如水，空气），即使在细菌死亡后，细菌性的内毒素仍然存在。

 

 

内毒素检测十分重要，热原反应会危及生命

由于内毒素是细菌死亡裂解或自溶引起的，因此环境中大量存在内毒素。当内毒素通过机体消化道等方式时并无危害，少量通过注射等方式进入血液后被肝脏细胞灭活，不造成机体损害。内毒素大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”。内毒素大量进入、集聚于血液中，超过机体各自系统的清除能力，则可导致不同程度的内毒素血症。

热原反应是指含有热原的注射剂注入人体可引起发热反应，使人体产生发冷、寒战、体温升高、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。

内毒素血症可以出现在多系统的多种疾病中，通常导致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等，死亡率极高。

因此，内毒素的去除对于人类疾病治疗的注射型药品、生物制品等都是必须的，尤其对于基因药物、蛋白药物、抗体药物、疫苗等生物制品的下游纯化处理来说就显得非常重要。

现在新冠疫情如此严峻，疫苗开发如火如荼，若是这些注射用疫苗残留内毒素或者被内毒素污染了，将带来十分严重的后果。

 

 

鲎试剂是内毒素现用的检测方式，存在一定局限性

鲎试剂是从海洋动物鲎提取的血细胞溶解物,是检测革兰氏阴性细菌内毒素的一种敏感试剂。鲎试剂会和内毒素起反应形成凝胶，是目前最常用的内毒素检测方法，采用成分复杂的海鲎血液细胞裂解物作为原料具有无法克服的缺陷。

非特异性干扰问题：鲎试剂除了能与内毒素反应外，还会与(1-3)-β-D-葡聚糖反应，造成假阳性结果，存在非特异性干扰。

批次稳定性问题：鲎试剂采用海鲎血液作为生产原料，由于季节、地域等差异，使得鲎试剂的批次差异成为常见现象。

环境污染以及大量捕捞造成海洋中鲎数量种群的减少导致原材料越来越难以获得。

 

 

 

重组C因子法（rFC）带来新的解决方案，无动物源灵敏安全可靠

Lonza PyroGeneTM重组C因子试剂盒是内毒素检测方法的发展成果。通过体外重组鲎凝血级联反应的第一个组分：C因子，重组C因子法只需一部反应，优于传统LAL法且不依赖动物源成分-鲎血。

PyroGeneTM重组C因子法，激活的C因子直接剪切一个荧光底物，产生的信号被荧光酶标仪识别。由于荧光信号的动态范围大，相较于传统的动态LAL法，PyroGeneTM重组C因子法只需一步反应，检测范围即可达到5.0EU/ml – 0.005 EU/ml。

▲上图分别展示了PyroGeneTM重组C因子与传统LAL法，如动态显色法和动态浊度法的激酶级联反应。

 

与经典的鲎试剂内毒素检查方法相比，重组C因子内毒素检测法具有更高的特异性，更好的专属性、精密度、准确度、线性范围及定量限，是目前鲎试剂内毒素检测方法的改良方法，具有以下优点：

内毒素特异性，重组技术消除了鲎试剂中β-1,3-葡聚糖对检测结果的干扰，导致潜在假阳性的产生

不依赖动物源性成分，提供更高的供应安全性

重组表达生产，产品批间一致性良好

终点荧光测定，与其他定量鲎试剂方法相当

灵敏度范围从0.005到5EU/ml

消除了对动物源试剂的依赖，符合3R的替代原则

药典推荐

可替代传统鲎试剂用于人用和动物用注射药物（如化学药品、放射性药物、抗生素类、生物制品等）及医疗器械（如透析液、植入式器械等）的原辅材料、中间产品、放行产品的内毒素检测。

 

 

重组C因子法合规审批历史

2012年6月，美国食品药品管理局(FDA)发布了“工业热原与内毒素检测的问答指南”文件，将重组C因子法作为LAL法的替代内毒素检测方法*。

2015年7月，欧洲药典在新起草的章节5.1.10中将重组C因子法作为LAL和家兔热源测试的替代内毒素检测方法*。

2016年7月1日，章节5.1.10正式生效。美国食品药品管理局(FDA)已经允许了510（K）使用PyroGeneTM重组C因子法进行内毒素放行检测的药物临床申请。

2018年9月，美国食品药品管理局(FDA)首次批准使用重组C因子法进行细菌内毒素放行检测的药物，一款用于治疗成人偏头痛的单抗药物。

2018年12月，欧洲药典起草了重组C因子法细菌内毒素检测的新章节2.6.32。

2019年1月，继欧洲药典(EP)、日本药典(JP)和美国药典(USP)之后，第4版本的中国药典将重组C因子法列为细菌内毒素检测方法，并将在2020年生效。

* 参见美国药典(USP)

Lonza rFC 产品

 

关于Lonza

LONZA（龙沙）集团是一家以生命科学为主导，总部位于瑞士，旗下20多家生产厂和研发中心遍布全球各地。龙沙是世界医药、保健及生命科学领域的领先供应商之一，其产品和服务满足客户从研发到终端产品制造的需求。截至2019年底，龙沙在全球拥有100多个生产基地和办事处以及约15,500名全职员工。2019 年，公司销售额达59亿瑞士法郎，核心业务的息税折旧摊销前利润（EBITDA）达16亿瑞士法郎。

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