【评测】肠道微生物核酸提取试剂盒

在人体肠道中大约有10万亿个微生物，构成肠道微生物群。其中99%以上为细菌（约有1000种以上），接近人体体细胞数量的10倍，是人体最庞大，最复杂的微生物系统。肠道微生物作为人体“微生物器官”，与人体健康密切相关，自2007年以来，肠道菌群方向相关的研究呈爆发式增长，成为当前一项热门研究领域。

图：肠道菌群研究项目数量和资助金额不断攀升

 粪便样本在肠道微生物样本中占据半壁江山，相比其他样本类型，粪便样本的获取是无创的，且粪便中微生物可为洞察代谢状态、人类/动物的健康/疾病状态及与肠道菌群的共生情况提供有利信息，可用于后续16s测序及宏基因组测序。因此，粪便核酸提取对于肠道微生物研究很重要！下面我们一起来看看从粪便样本中提取肠道微生物核酸需要注意的点吧，避免大家踩坑~

NO.1 宿主选择

● 以上五类因素都可能导致肠道微生物菌群结构发生改变，在选择适宜的样本宿主之前，都需考虑在内，避免影响到后续试验。

NO.2 建议样本要均匀

无论是哪种来源的粪便样本（尤其是硬的粘稠的），可能并不是均一的，由于粪便内外部含氧量不同，从而造成粪便内外部需氧菌/厌氧菌比例不同，进而影响实验的准确性。

表1

图1

● 表1与图1所示，与未均一化的样本相比，事先均一化的样本在用qPCR检测肠道微生物主要细菌类群时具有更小的变异度。且与外部样品相比，内部样品的拟杆菌和双歧杆菌显著减少【1】

NO.3 避免反复冻融

样本收集好之后若不能立即进行检测，需要先将样本进行保存，那粪便样本应该如何保存呢？

● 对肠道微生物，快速冷冻到-80℃通常被认为是最佳的保存方案。图2所示，新鲜样品（蓝）、干冰速冻后-80℃样品（红）、-80℃样品（绿），-80℃冷冻后样品与新鲜样品相比，无明显变化，只是厚壁菌门/拟杆菌门比值略有上升【2】

图2

● 如图3所示，在室温、4℃冷藏以及-20℃下的粪便样本进行检测，-20℃保存粪便样本，拟杆菌在第14天下降，而厚壁菌门在储存第3天下降，拟杆菌与厚壁菌的比例在第7天发生较大变化【1】

图3

● 而在室温下，粪便样本30min内即可发生较大变化。拟杆菌有下降趋势，厚壁菌则有上升趋势。因此粪便样本-20℃保存样品尽量低于三天，室温条件下尽量不超过30min。4℃保存则一般建议不超过24-48小时，4℃下保存时间过长容易导致真菌的生长【3】

图4

● 在运输过程中保证足量干冰冷冻运输，并且建议样本预先分装。样品冻融四次后，粪便中微生物出现显著变化，尤其是解冻后样品操作时间（大约10min）越长，样品中微生物变化越大，因此切记不可反复冻融样本！

泽平科技 MP核酸提取试剂盒

核酸提取是指将细胞内核酸通过物理或化学方法释放出来，再通过吸附或者沉淀的方法进行收集。以核酸释放方法来看主要有珠磨法、加热、酶和化学裂解几种方法。

细胞裂解和DNA回收都会影响DNA最终产量，但只有细胞裂解会影响到最终核酸中DNA的组成。珠磨法可以释放更多种微生物DNA核酸，因此大多数实验更建议采用珠磨法。

珠击的力度和时间对DNA提取影响较大，珠击力度增大，时间增长，会提高DNA浓度，但是会造成DNA剪切加重，导致DNA质量下降。MP可提供优质的样品裂解仪以及全面的裂解介质，FastPrep-24ᵀᴹ 5G样本制备仪，动力强劲，独特模式的机械震动带动研磨介质与微生物高速碰撞，在短时间内裂解样品中的微生物。

除上述裂解系统以外，核酸提取当然离不开试剂盒咯~目前MP已推出了三款粪便样本核酸提取的试剂盒，针对不同实验需求，给客户更大的空间选择适宜的产品。

Q：如何选择合适的MP粪便DNA提取试剂盒？

MP根据不同方法学贴心为大家做了以下指南区分，供参考：

与市面上其他常用的试剂盒进行比较，MP试剂盒提取各粪便样品DNA浓度均明显高于其他品牌，提取DNA纯度，260/280比值在1.8-2.0，260/230在1.3以上纯度较高，而其他品牌或多或少存在RNA、蛋白或者盐离子污染。

以SPINeasy DNA Kit For Feces为例，操作简便快捷，单个样品操作不超过20min，适用于各种粪便样品，提取DNA浓度高，260/280比值在1.8-2.0，260/230在1.3以上纯度高，并且提取DNA均可用于后续PCR实验。

表：SPINeasy DNA Kit for Feces提取DNA收率及纯度结果

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相关文献：

1.Methods for ImprovingHuman Gut Microbiome Data by Reducing Variability through Sample Processing andStorage of Stool Monika A. Gorzelak, Sandeep K. Gill, Nishat Tasnim, ZahraAhmadi-Vand, Michael Jay, and Deanna L. Gibson*

2.The Effects of Freezing on Faecal Microbiota asDetermined Using MiSeq Sequencing and Culture-Based Investigations Fiona Fouhy,1  Jennifer Deane, 1 , 2 , 3  Mary C. Rea, 1 , 4  Órla O’Sullivan, 1 , 4  R. Paul Ross, 5  Grace O’Callaghan, 2 , 4 , 6  Barry J. Plant, 2 , 4 , 6  and Catherine Stanton 1 , 4 ,*

3.Optimization offecal sample processing for microbiome study d The journey from bathroom tobench Wei-Kai Wu a,b, Chieh-Chang Chen c, Suraphan Panyod b,d, Rou-An Chen b,Ming-Shiang Wu c,d, Lee-Yan Sheen b,**, Shan-Chwen Chang c,d,*