PEI转染试剂说明书（贴壁细胞转染）

你了解过Polysciences PEI转染试剂说明书（23966-1）吗？

以6孔板转染293T贴壁细胞为例。

（一）转染前准备

1) 转染前一天：用胶原酶（WORTHINGTONG 公司 LS004196)消化细胞并计数（不建议用胰酶）。按照每孔2×106的细胞量接种293T至6孔板(每孔加入2ml新鲜的DMEM:F12+5%FBS 完全培养基和1ml的细胞悬液)置于37℃，5%CO2培养箱培养24h。

2) 24h后，移除之前培养基，每孔加入2ml新鲜的转染DMEM:F12+5%FBS。

注意：确保 293T 细胞生长状态良好传代不超过 15 代。

（二）转染过程

3) 第一天：显微镜下检查细胞汇合度，当细胞至少达到 70%到 80%的汇合度时，开始准备转染。

4) 对于每孔细胞，用100µl无血清培养基（如 OPTI-MEMⅠ培养基）稀释 DNA，使 DNA 终浓度为1ug/ml（DNA/总培养体积）。

5) 对于每孔细胞，用100μl无血清培养基（如 OPTI-MEMⅠ培养基）稀释适当比例的适量PEI 25000。DNA:PEI 的比例要依据自己实验摸索最适比例。

6) 将稀释的PEI 25000转染试剂加入到稀释的质粒中（总体积 200µL）轻轻混匀，室温孵育30分钟。

7) 小心地将PEI-DNA复合物滴加到细胞培养板每个孔中，轻轻摇动培养板混匀。注意加入混合液时轻轻沿着孔板边缘滴入，而不是在细胞的顶部以免破坏细胞的粘附性。

8) 将培养板放入 37℃，5%CO2培养箱培养中培养24h。

（三）观察转染结果

9) 第二天：在荧光显微镜下观察细胞转染效率，通常超过80%的293T细胞在转染后的 24h可以观察到绿色荧光。

Polysciences PEI转染试剂说明书（23966-1）小贴士：

1)建议进行不同基因转染时应对PEI和DNA的比例进行优化，以达到最适比例，通常

筛选范围在1:1到5:1之间。

2)通常情况下，分别准备PEI和DNA转染溶液，其体积一般是转染前每孔细胞培养液体积总量的1/10-1/20，如细胞培养液体积为3ml，则稀释PEI及DNA的体积为150ul。质粒 DNA 的浓度通常为1ug/ml（DNA 质量/细胞培养总体积）。不同质粒种类以及大小会影响转染效率，如较大片段插入质粒可能转染效率低，可根据实际实验需要调整，如适当增加转染质粒总量等。

 3)HEK293GnTI细胞重悬浮可用枪头或移液管反复吹打，但CHO-S细胞的粘附性比较强

重悬浮时需要借助细胞刮刀。

4)一般建议用胶原酶消化细胞，如果表达的是膜蛋白，胰酶消化细胞可能会降低蛋白表达，建议用胶原酶消化细胞，我们推荐用(LS004196，WORTHINGTONG)的胶原酶。

5)对于贴壁性低的细胞系，可用明胶或鼠尾胶铺板，增加细胞与培养皿之间的粘附性。一旦确定了细胞类型、培养基和 PEI 与 DNA 的最佳比例，就可以在转染后24至96小时内多次观察转染效率，以优化最大表达量时间点。