文献解读：母乳喂养对新生儿病毒分步组装的调控

研究简介
病毒在健康新生儿肠道中的定植通常发生在出生之后，而在后续不同的环境下，有些病毒的定植会引发新生儿肠道疾病。在过去的数十年中，母乳喂养对婴儿健康的益处在众多研究中得以证明，如增强免疫力、提升智力、减少儿童期肥胖和减少罹患过敏性疾病的几率等，但是对母乳喂养影响婴儿生长与健康的机制仍然知之甚少。

2020年4月15日宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院 Frederic D. Bushman教授研究团队在Nature上发表了题为The stepwise assembly of the neonatal virome is modulated by breastfeeding的研究性论文，该研究揭示了新生儿病毒群落的组装是分步进行的，通过母乳喂养可以调节新生儿病毒的逐步组装，抑制病毒在人体细胞中的定植与发展。

研究结果：
首先为了研究新生儿体内早期的病毒，研究团队收集了20名健康婴儿不同阶段的粪便样本。通过颗粒富集和SYBR染色，观察到出生后的11-152小时内，17/20的新生儿粪便样本中还检测不到病毒样颗粒（图1a）；而1个月大时，大多样本中已经都能检测到，且每克样本中病毒样颗粒数多达1.6 × 109；4个月大时情况相似。作为对照，研究团队还检测了122名5岁儿童粪便样本中的病毒样颗粒数量，发现与婴儿时期差别不大（图1b）。研究团队因此推测，婴儿在1个月时的肠道病毒数量通常会持续到成年期。

为了确定病毒的来源，研究团队首先对粪便样本中的微生物进行了16s qPCR检测以确定粪便样本中细菌总体含量。结果显示，0个月时，14/20的新生儿粪便样本中的检测不到或检测极低含量的16s rRNA，而另外6个样本中的16s rRNA copy数量也只为3.3×106/克（粪便）；而在1个月和4个月样本中，细菌DNA已经占主导地位，到达3.1×108/克（图1c）。通过宏基因组测序，新生儿样本多为人类基因组DNA，1个月和4个月样本中，细菌的丰度和多样性很高。更重要的是，通过对病毒颗粒中DNA与RNA病毒的测序。婴儿1个月大时，检测到病毒种类也开始增加，能够识别到大多病毒样颗粒为噬菌体家族（可以感染细菌的病毒）（图1d和1e），4个月大时，真核病毒（Adenoviridae, Anelloviridae, Caliciviridae和Picornaviridae.）变得更为显著（图1e）。在这里，由于肠道噬菌体在全部噬菌体中占比很少，而噬菌体是肠道病毒组的主要构成。为了增加比对的精确度，研究团队将测序reads组装为contigs，并将contig内的一半阅读框注释为该contig可注释到的病毒。随后通过对细菌和病毒的丰度与多样性的关联研究发现，两者直接有着很强的相互作用。

图1：婴儿肠道样本中病毒颗粒的检测与特征。

噬菌体的复制方式分为溶解模式或溶原模式（详见病毒组系列2）。之前有研究证明，婴儿的肠道噬菌体与成人相比较，溶解模式为主导地位。为了进一步对噬菌体复制方式以及噬菌体和病毒样颗粒基因进行探索，研究团队将从样本中分离24株细菌，其中包括3株Escherichia coli, 3株Klebsiella和10株Enterococcus，后用同源的病毒颗粒进行感染。结果发现并没有噬菌体斑形成，说明婴儿肠道噬菌体并不是溶解模式。通过PHACTS（基于随机森林对噬菌体复制方式的分类方法）对病毒颗粒DNA的contigs分析，发现大部分基因组更倾向于比对到温和噬菌体，而非烈性噬菌体。研究团队又对上述24株细菌别进行了有氧和无氧的培养，用裂丝霉素C诱导不同条件下的细菌后，重新富集病毒颗粒，并染色观察。结果发现，裂丝霉素C诱导后，80%的菌株释放了病毒颗粒，而刺激前只有32%（图2a）。无论从基因数据还是微生物实验都证明诱导可刺激婴儿的肠道细菌释放更高水平的病毒颗粒。
为了进一步验证诱导所产生的病毒颗粒是否来源已整合到细菌宿主DNA上的原噬菌体，研究团队又对上述24株细菌和诱导前后这24株细菌分别释放出的病毒颗粒进行基因组测序。通过对两者的比较发现很高的同源性。而后对比来自纯化细菌的病毒颗粒和粪便病毒颗粒数据，发现同源样本具有很高的一致性。此外特定菌株在肠道菌群中的丰度与其源噬菌体在病毒组中的丰度成正相关（图2b、2c和2d）。

crAssphages以Bacteroides为宿主，在复制中并不整合到宿主基因组中。在1月大的样本中，crAssphages丰度极低，而在4月大婴儿及2-5岁儿童的肠道中却普遍存在。这证明该烈性噬菌体主要在出生后期出现，其原因或许是需要“先锋细菌” Bacteroides先定植于肠道。

至此，上述研究发现“先锋细菌”首先在婴儿肠道内定植，随后噬菌体作为病毒组的主要成分，定植于肠道。

图2：原噬菌体（Prophage）作为生命早期肠道病毒组的主要成分

为了了解病毒定植的影响因素，研究团队将来自这20例婴儿的粪便样本病毒数据与喂养史、出生方式和性别等因素进行对比分析，发现母乳喂养有很强的影响，与可在人体细胞内复制的病毒的积累量较低有关。覆盖33%病毒基因组的检测结果显示，仅在以配方奶喂养的婴儿样本中发现了可感染人细胞的病毒（图3a）。
为了验证这一发现，研究团队分析了额外125名婴儿在3-4个月大时的粪便样本的宏基因组数据。结果显示，30%喝配方奶的婴儿的粪便样本中可检测到人体病毒。相比之下，纯母乳喂养或混合喂养的婴儿中，这一比例仅为9%。该结果通过对Adenovirus、Torque teno virus、Enterovirus、Astroviridae、Sapovirus和Norovirus的qPCR数据得以验证（图3b）。在100例非洲新生儿样本中，qPCR结果再次得到印证。这提示该现象可能广泛存在（图3b）。
此外，对配方奶进行病毒纯化和分析，也未检测到可感染动物细胞的病毒，表明这些病毒不太可能源于配方奶的污染。
进一步分析表明，喂养方式也影响了病毒种类。母乳喂养婴儿粪便样本中能检测到有较高水平的双歧杆菌（Bifidobacterium）和乳酸杆菌（Lactobacillus），以此为宿主的病毒（噬菌体）基因序列也更丰富（图3c和3d）。

图3：母乳喂养对婴儿肠道病毒定植的影响

结论：

总结来看，这些发现表明，婴儿出生后，其肠道内的病毒定植过程或许受到母乳喂养的调控。病毒定植分阶段发生：第一阶段主要是“先锋细菌”定植后引入噬菌体，在第二阶段，可感染人类细胞的病毒定植，而第二阶段与喂养方式有关。这项研究加深了对于母乳喂养保护作用的理解，同时强调了潜在干预或可减少婴儿感染（图3e）。

参考文献：
Guanxiang Liang, et al., (2020). The stepwise assembly of the neonatal virome is modulated by breastfeeding. Nature, DOI: 10.1038/s41586-020-2192-1

文中病毒组研究方法：

1. 病毒颗粒富集：
200mg粪便样本于SM缓冲液中匀浆，离心后过0.2μm滤膜。滤液用100-kDa-molecular-mass Amicon Ultra-15 离心滤膜浓缩。30ml重悬后离心，浓缩到500μl。

2. 数据库：
UniProt Knowledgebase（TrEML和Swiss-Prot）中的病毒蛋白数据库；NCBI nt数据库。