精准医学：新型甲基化DNA标志物在大肠癌复发监测中的应用｜复发预防专题

摘要

目的：本研究是为了评估大肠癌相关的甲基化DNA标志物(MDM)在原发性和转移性大肠癌中的一致性，为利用血浆检测远端复发或转移的大肠癌提供可行性。

实验设计：选择了一组已报道的与大肠癌相关的MDM标志物。用甲基化特异性定量PCR检测原发性和转移性大肠癌组织中的MDM。用靶标富集长探针定量放大信号法测定血浆中的MDMs。用随机森林模型对原发性大肠癌患者血浆样本中MDM的进行预测。该模型算法在预先采集的复发大肠癌患者的血浆样本中得到了验证。随机森林模型是较为灵敏和特异的，其准确性可以用曲线下面积(AUC)来进行评估。

结果：在选定的14个MDM中，有12个MDM(86%)在原发组织和转移组织之间的具有中度或高度的一致性。预设特异性为95%(91%-98%)的情况下，在97例大肠癌患者和200例健康对照者的血浆中有13个MDM对Ⅳ期大肠癌的敏感性为100%(80%-100%)，AUC为0.91(0.87-0.95)，显著高于癌胚抗原,AUC为0.72(0.65-0.79)。这组MDM在40例患者和60例健康对照者的血浆中，复发/转移性结直肠癌的敏感性为90%(76%-97%)，特异性为90%(79%-96%)，AUC为0.96(0.92-1.00)。它们在60例大肠癌术后无疾病的患者中，呈阳性的概率为0.30(0.19-0.43)。

结论:针对新型大肠癌关于血浆MDM的监测系统可以可靠地检测出原发性大肠癌和复发、远处转移的大肠癌，并且具有良好的准确性。

介绍

尽管目前癌症的筛查和治疗工作都取得了进展，但结直肠癌仍然是最常见和最致命的癌症之一，这部分归因于结直肠癌的筛查率。此外，接受根治性切除手术的患者近一半会有复发的情况。几项大型研究表明，通过血液和影像学检查这种综合监测手段可以检测症状前的复发，并改善转移性疾病的预后，在这些转移性疾病中，治疗可指向治愈。

目前的监控工具精度不高，成本昂贵。其中影像学检查可能会遗漏病灶或弥漫性病变，无法反映总体肿瘤情况。而生物标记物，血浆癌胚抗原(CEA)，敏感性和特异性较低。因此，显然需要一种比癌胚抗原具有更好的性能特征、成本更低、灵敏度更高的非侵入性监测工具。

循环DNA (cfDNA)突变标记的液体活检在改善结直肠癌切除患者的预后中显示出很高价值。然而，这种方法对于筛查或监测早期的结直肠癌是不实用的，因为必须要有大量突变位点以供分析。对每个个体原发性肿瘤确定的突变定制靶向标记物的策略包括高成本的测序和特定的监测分析，但是由于转移的遗传进化等因素，不能保证这些靶点在患者治疗过程中保持稳定。

甲基化的DNA标记物(MDM)在筛查和监测结直肠癌方面与现有工具相比具有几个优势(图1A)。有研究表明，在检测原发性结直肠癌方面，检测MDM优于CEA。MDM是原型表观遗传标记，在结肠直肠癌筛查中也比获得性突变标记携带有更广泛的信息，具有一定的敏感性。它与结直肠癌体细胞遗传突变的获得性分子差异相似，一些MDM与肿瘤行为和对辅助化疗的反应相关，反映了肿瘤的异质性。我们团队曾利用新一代测序方法发现了一种与原发性结直肠癌组织密切相关的新型MDM，我们现假设这种MDM可以应用于液体活检来检测早期原发性结直肠癌和无创检测复发性结直肠癌。

本研究有三个平行且独立的目标。首先，我们试图评估结直肠癌原发和转移之间MDM候选标志物的一致性(原发性和转移性组织MDM一致性研究)，高一致性的MDM将应用在复发疾病的检测中。其次，我们通过检测早期结直肠癌患者和健康对照(早期结直肠癌初步检测研究)血浆中MDM，为监测研究设定标志物的临界点水平，以此来评价MDM在结直肠癌早期诊断中的敏感性和特异性。最后，开发的检测早期原发性结直肠癌的检测模型会被应用于第三类病例的进行对照研究，以确定接受过治疗的结直肠癌患者复发或转移性的可能性，并与那些没有放射学证据的结直肠癌患者(NED)和健康对照(MDM血浆结直肠癌监测研究)进行比较。

图1：MDM在转移性结直肠癌中的使用与基于突变的生物标记物进行比较的研究原理(A)和三项主要的平行研究概述(B)。(1)原发和转移组织MDM一致性研究，评估原发和转移结直肠癌MDM随时间变化的一致性；(2)MDM血浆结直肠癌早期初步检测研究，评价MDM对原发性结直肠癌早期发现的敏感性和特异性；(3)MDM血浆结直肠癌监测研究，评价MDM检测复发和转移结直肠癌的敏感性和特异性。

材料和方法

所有研究程序都是在Mayo研究所(Rochester, MN)机构审查委员会根据美国共同规则(卫生与公众服务部第45CFR第46条)批准后进行的。

MDM在原发和转移组织的一致性研究

手术切除的原发和转移性结直肠癌，包括同步或异时转移，是从Mayo诊所组织登记处(Rochester, MN)得到的，可以根据SNOMED病理诊断代码的查询。同步转移是指发生在3个月内的远程转移，异时性转移是指相对于最初诊断的结直肠癌超过3个月的转移。与供者签署书面同意，且供试者年龄至少18岁；排除标准为所研究肿瘤部位的放射史和已知的家族性癌症综合征(如林奇综合征和家族性腺瘤性息肉病)。在取回福尔马林固定的石蜡包埋的组织标本后，胃肠病理学家(T.T.Wu)证实了诊断，根据病理切片确定了肿瘤的位置，并估计了肿瘤的纯度。相关的人口统计学、临床和组织病理学信息被标注在存档了的肿瘤样本来源的患者身上。临床表型由研究人员根据预先指定的方案进行统计，并由临床医生专家(谢海峰)审查其准确性。

根据MDM水平[四分位数区间(IQR)，155-12,476]的较高中位数，选择了一组由14个MDM(VAV3，CHST2，OPLAH，QKI，PPP2R5C，ARHGEF4，PDGFD，ZNF625，SFMBT2，LRRC4，DOCK10，IKZF1，NDRG4和BMP3)构成的MDM组，它们是之前被确定为对原发性结直肠癌具有高度特异性的MDM。如前所述，使用定量甲基化特异性PCR(MSP)来测量每个选定的MDM。简而言之，用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research)对DNA进行亚硫酸氢盐处理，并在缓冲液中洗脱。将亚硫酸氢盐处理过的DNA作为模板，用基于荧光的实时PCR进行甲基化定量。每个标记的引物被设计成针对每个基因的亚硫酸氢盐修饰的甲基化序列(集成DNA技术)。β-肌动蛋白基因中没有CpG位点的区域被用作亚硫酸氢盐处理的参考。组织DNA样品用SYBR Green Master Mix(Roche)进行PCR。所有反应均在Roche 480型LightCycler上进行。以双硫代甲基化的CpGenome通用甲基化DNA(微孔)作为阳性对照，并连续稀释以生成标准曲线。

血浆中MDM检测早期原发性结直肠癌的初步研究

在未治疗癌症档案(ClinicalTrials.gov NCT03662204)的患者中，分别采集了健康对照(ClinicalTrials.gov NCT03628638)和结直肠癌患者的6mL血浆，这些患者在2018年9月1日至2019年3月31日期间提供了书面知情同意。患者均未先前或同时诊断出其他癌症，主要是指在过去5年内任何的癌症诊断(基底细胞或鳞状细胞皮肤癌除外)；在任何时间范围内同一原发癌复发；或同时诊断出多原发癌。值得注意的是，如果靶病理细针抽吸(FNA)与采血间隔小于3d，靶病理活检(FNA除外)与采血间隔小于7d，或在采血后24h内接受静脉造影剂(如CT、MRI)检查，则不能使用该标本。

整个外周静脉血液样本采集在LBGuard Tubes(Biomatrica)中，它使用专有的核酸保存介质来维持细胞完整性和目标DNA分析物回收，并可以在采集后8天内在室温下对样本进行集中处理。

取储存在﹣80℃下的血浆样品。从样品中提取DNA(QIAamp Circulating Nucleic Acid试剂盒，Qiagen)，再进行亚硫酸氢盐转化。由于血浆中cfDNA丰度较低，选用的MDM主要采用由Exact Sciences开发的靶向富集长探针定量放大信号(TELQAS)方法进行检测和定量，该检测方法的详细步骤已在以前公布。简而言之，对亚硫酸氢盐转化的DNA进行有限循环(12个循环)多重PCR扩增MDM。PCR产物用10 mmol/L Tris-HCl和0.1 mmol/L EDTA溶液稀释10倍，取10μL稀释后用于三重LQAS分析，定量两种MDM。MDM被归一化为B3GALT6的甲基化序列，B3GALT6是亚硫酸氢盐转化的总DNA输入的量度。TELQAS反应在ABI 7500DX设备(应用生物系统)上进行。本实验中MDM的TELQAS检测是独立于组织研究结果而设计的，而VAV3、CHST2、QKI、PDGFD和SFMBT2在组织研究中是常见的。因为这些研究是非顺序进行的，所以在临床前实验中显示与结直肠癌有很强相关性的其他MDM被测试。由于TELQAS多路复用能力的限制和血浆中cfDNA含量的限制，不能同时研究所有感兴趣的MDM。因此，血浆研究检测了额外的新候选基因：JAM3、ZNF671、ZNF568、GRIN2D、DTX1、ANKRD13B、CNNM1和FER1L4。CEA检测是根据制造商的说明使用Cobas E411免疫分析分析仪(罗氏诊断公司)对10微升的血清样本进行的。

MDM血浆结直肠癌监测研究

病例人群包括那些接受积极治疗的新诊断或复发的结直肠癌患者，还包括那些II-IV期结直肠癌患者，这些患者在接受治疗后目前患有NED。患者们都接受了CEA和放射学的常规临床检查。在这项平行研究中，健康的非癌症患者的血浆样本作为阴性对照。

血浆CEA和血浆MDM大肠癌早期检测研究中使用的MDM是从年龄和性别都较为平均的患者中测定的，包括健康对照组、NED患者和初次肿瘤切除后复发的大肠癌患者。来自早期结直肠癌初步检测前期研究(上文)的交叉验证MDM预测模型被用于区分复发或转移性癌症(病例)和健康对照。然后将预测精度估计应用于NED疾病对照组，以估计可能有微小残留病的患者的百分比。

收到血样后，立即旋转分离血浆和棕黄色涂层组分，保存在﹣80℃下，经DNA提取和亚硫酸氢盐转化后，对选定的MDM进行TELQAS初步检测和定量。本研究使用血浆样本(4mL)检测MDM。使用10微升的血浆进行CEA分析，将血浆CEA结果与同一时间点收集的结直肠癌患者的临床血清值进行比较。

统计分析

对于原发和转移组织MDM一致性研究，用组内相关系数(ICC)来评估原发和转移结直肠癌组织中MDM水平之间的一致性水平，包括总体上的组内相关系数(ICC)和按同步和异时表现分层的组内相关系数(ICC)。简而言之，ICC总结了由于原发和转移性结直肠癌组织之间的差异(不一致性)而观察到的单个MDM水平总变异的百分比。根据Koo和Li的指导，ICC被认为是指示差，ICC<50%；中等，50%≤ICC<75%；良好，75%≤ICC<90%；以及优秀，ICC≥，相对于95%可信区间(CI；REF)的下限，符合率为90%。所需的样本量是在将ICC的95%CI的宽度限制为不大于±10%的基础上进行总体比较的基础上确定的。为了达到这个置信水平，假设ICC为30%，至少需要77名原发灶和转移灶配对的患者。除了用95%的CI汇总ICC外，原发癌和转移性结直肠癌组织之间的相对差异在对数尺度上被总结为相应的第25和75%的中位数和百分位数。

在大肠癌早期诊断先导研究中，共有14个MDM，包括B3GALT6和血清CEA检测。每个MDM TELQAS产品都被标准化为甲基化的B3GALT6，最近被证明是比β-肌动蛋白血浆分析更可靠的归一化序列，应用于测试数据集(即，结直肠癌监测数据)内的病例和对照。数据用于使用所有14个MDM(具有和不具有连续的CEA值)针对结直肠癌的随机森林(RForest)预测算法(交叉验证)。简而言之，rForest模型由500个数据的引导随机样本组成。每个引导样本用于创建单个递归分区/决策树，从而产生500棵树(每个引导样本一个)。来自独立样本(例如，在500棵树中约1/3的个体未被用于训练)的独立样本的数据根据标记水平被分类为结直肠癌(Y/N)，并记录独立样本的结直肠癌阳性树的百分比。在训练了模型之后，确定了将某人归类为结直肠癌所需的阳性树百分比的分界值(Y/N)，并将其设置为在95%的特异度分界值下执行预测。然后将该模型直接应用于结直肠癌监测数据(测试集)，如果阳性树的百分比超过训练集的预定义截止值，则单个样本被认为是阳性的。假设对照与病例的比例为2：1，总共有14个生物标志物，训练的模型的平均绝对预测误差为±10%，则至少需要175名患者的总样本量。另一个考虑因素是要有足够的样本量，以便使用Bootstrap重采样进行模型灵敏度的交叉验证。为了使估计敏感度90%的95%可信区间不大于±10%，总共需要150名患者(50例患者和100名对照)用于测试集。结合这些要求，总共300名患者的总体研究样本量是足以进行训练和交叉验证的，训练：测试使用引导抽样方案实现的数据分割的比率约为2：1。

在MDM血浆结直肠癌监测研究中，样本量是基于将使用MDM水平(有或没有CEA)训练的预测的受试者工作特征(ROC)曲线(AUC)下的面积与单独使用CEA进行比较。根据估计的63%的敏感性和88%的特异性，CEA的预期AUC为0.75。要检测80%功率的MDM水平的AUC为0.85或更高，假设显著性为5%的单边检验，则至少需要64个病例和64个对照。在64例病例和64例对照中，假设每个病例的灵敏度和特异度均大于0.85，其95%可信区间的半宽度不大于±10%。在使用血浆中MDMS的早期原发性结直肠癌检测试点研究中建立的有CEA和不有CEA的模型被应用于预测复发/转移的结直肠癌患者的癌症诊断，并与健康对照组进行比较。然后对患有NED的患者评估该模型的阳性率。ROC分析用于评估训练模型的诊断准确性，并总结为AUC和相应的95%CI。通过比较分层AUC，评估RECIST标准测量的肿瘤负荷与训练模型诊断准确性的相关性。

连续变量用IQR总结为中位数，分类数据总结为组总数的百分比。非参数检验用于患者亚组之间的比较(例如，顺序数据的Wilcoxon秩和检验和分类数据的Fisher精确检验)。

结果

图1B显示了三个主要实验的概述，用来检验我们的中心假设，即新的候选MDM在配对的原发和转移性结直肠癌组织之间是一致的，并且一组这样的MDM不仅可以成功地检测原发结直肠癌，还可以成功地检测血浆样本中的复发或转移性结直肠癌。

原发和转移组织MDM一致性研究

如补充表S1所示，MDM组织研究包括84例原发结直肠癌和转移性结直肠癌患者，其中56例为同步转移，28例为异时转移。原发性结直肠癌切除患者的年龄中位数为60.2岁。41例(49%)患者接受新辅助治疗，56例(67%)患者接受辅助化疗。56例(67%)患者患有左侧结直肠癌。所有同步转移均发生在肝脏。异时性转移17例(61%)为肝转移，10例(36%)为肺转移。在14个选定的MDM中，1个MDM(7%)的CI大于≥75%表示一致性良好，9个(64%)的ICC≥为50%表示中度一致性，3个(21%)在综合考虑所有转移时一致性较差(补充表S2)。在配对的原发结直肠癌和转移性结直肠癌中，选定的14个MDM非常相似(图2A)。当选择原发和同步转移性结直肠癌(图2B)、原发和异时转移性结直肠癌(图2C)、左侧原发和转移性结直肠癌(图2D)以及右侧原发和转移性结直肠癌(图2E)时，这14个入选的MDM中的大多数水平是相似的。

在使用血浆中MDM的早期原发性结直肠癌检测先导研究和MDM血浆结直肠癌监测研究中，所有样本在亚硫酸氢盐转化和靶扩增后都含有至少20000条B3GALT6。所有被检测的样品都包括在分析中。

图2.原发性和转移性结直肠癌组织MDM水平的差异。当将原发肿瘤水平除以转移肿瘤水平时，差异表现为中位数和IQR倍数变化。总体(A)；原发结直肠癌与同步转移结直肠癌之间(B)；原发结直肠癌与异时转移结直肠癌之间©；左侧原发结直肠癌与转移性结直肠癌之间(D)；右侧原发结直肠癌与转移性结直肠癌之间(E)。折叠值>1表示原发灶MDM水平较高；值<1表示转移灶MDM水平较高。

血浆中MDMS检测早期原发性结直肠癌的初步研究

然后，我们将选定的MDM应用于I-IV期原发性结直肠癌患者的血浆样本存档。包括97名结直肠癌患者和200名年龄和性别平衡的健康对照。大肠癌患者和健康对照组的年龄、性别和种族分布相似(表1)。控制组明显更有可能是现在或以前的吸烟者。大肠癌中，Ⅳ期23例(23.7%)，Ⅲ期23例(24.7%)，Ⅱ期26例(26.8%)，Ⅰ期11例(11.3%)。在95%(91%-98%)的特异度下，有CEA的13个MDM对所有大肠癌分期的交叉验证灵敏度为78%(69%-86%)；没有CEA的交叉验证灵敏度为77%(68%-85%)。模型的性能也被评估用于检测结直肠癌的各个阶段。在95%(91%-98%)的特异度下，有或没有CEA的13个MDM对I期大肠癌的交叉验证敏感性为64%(31%-89%)，对II期大肠癌的敏感性分别为62%(41%-80%)和65%(44%-83%)，对III期大肠癌的敏感性分别为79%(58%-93%)和71%(49%-87%)，对IV期大肠癌的敏感性为100%(85%-100%)。单个MDM和CEA的表现也被总结为AUC值，如图3所示。由13个MDM组成的小组能够检测到结直肠癌的所有阶段，交叉验证的AUC为0.91(0.87-0.95)。添加癌胚抗原对AUC值没有显著改善[0.91(0.87-0.95)；P？0.5415]。个体MDM和CEA对rForest模型在早期结直肠癌与健康对照的分类中的贡献的重要性如附图所示。S2A。在13个MDM中，甲基化的JAM3和ZNF761对整体交叉验证模型算法的性能贡献最大。模型的准确性不受原发肿瘤位置(直肠、左半结肠和右半结肠)的影响。

表1 使用血浆中MDM的早期原发性结直肠癌检测试点研究中患者的基本特征。


图3.在使用血浆中的MDM进行的早期原发性结直肠癌检测试点研究中，单个MDM、CEA和一组血浆中的MDM在区分早期结直肠癌和健康对照方面的表现。AUC，ROC曲线下面积。

MDM血浆结直肠癌监测研究

我们还应用选定的MDM前瞻性地采集了160例年龄/性别平衡的患者的血浆样本，其中包括60例健康对照、60例结直肠癌切除并NED患者和40例初次肿瘤切除术后复发的结直肠癌患者(包括10例辅助治疗后复发的结直肠癌患者和30例积极保守治疗的转移性结直肠癌患者)。患者的平均年龄为55岁(IQR，49-64岁)，CEA水平中位数为1.7 ng/mL(IQR，1.1-3.2 ng/mL；表2)。考虑到早期原发性结直肠癌检测的交叉验证模型的高度敏感性和特异性，使用血浆中的MDM检测IV期结直肠癌的初步研究，我们评估了该模型在检测复发结直肠癌中的作用。作为一项质量控制检查，在使用血浆中MDM的早期原发性结直肠癌检测先导研究和结直肠癌监测研究中，评估了MDM分布的潜在漂移。(JAM3，ZNF671，SFMBT2，CHST2对最终模型的性能贡献最大，研究之间没有明显的漂移)。然而，对于使用血浆中MDMS的早期原发性结直肠癌检测试点研究，CEA是从血清中检测的，而对于结直肠癌监测研究，CEA是从血浆中检测的。与其他被检测的标记相比，CEA的分布发生了明显的变化(补充图S4)。这不能用患者之间的介质(血清和血浆)的不同来解释，在这些患者中，可以获得临床可用的血清CEA值(补充图S5)。为了便于比较和使用根据早期原发结直肠癌检测先导研究数据建立的模型中相同的CEA截止值，通过在每个研究的对照之间观察到的平均CEA的比率，然后将该比例因子应用于结直肠癌监测研究中的病例和对照，得出了1.5的比例因子。在有或无CEA的MDM训练模型中，以95%的特异度为界值时，检测复发结直肠癌的灵敏度为90%(76%_{97%)，观察到的特异度为90%(79%}96%)。加CEA的MDM模型的AUC值为0.96(0.92~1.0 0)，与不加CEA的MDM模型相似(P＝0.45)，但明显优于单独使用CEA的MDM模型，AUC值为0.79(0.69~0.90；P＝0.0015)。

有或没有CEA的MDM训练模型预测NED患者复发结直肠癌的概率分别为0.32(0.20-0.45)和0.30(0.19-0.43)(图4)。有或没有CEA的MDM训练模型在前一次随访时发现NED患者的复发结直肠癌的灵敏度为80%(44%-97%)，检测到接受积极姑息治疗的患者的转移性结直肠癌的灵敏度为93%(78%-99%)。有或没有CEA的MDM小组检测复发的结直肠癌肝转移的敏感度为100%(86%-100%)，肺转移的敏感度为89%(52%-100%)，腹膜/淋巴结转移的敏感度为57%(18%-90%)。RECIST sum>4 cm病变的敏感度为100%(81%_{100%)，sum≤4cm病变的敏感度为83%(59%}96%)。有或没有CEA的MDM小组检测复发直肠癌的敏感度为92%(62%-100%)，左侧结肠癌的敏感度为95%(75%-100%)，右侧结肠癌的敏感度为75%(35%-97%)。与早期检测研究一样，NED或复发/转移性疾病患者的模型准确性不受原发肿瘤位置(直肠与左半结肠与右半结肠)的影响。

表2.MDM血浆CRC监测研究中患者的基本特征。


图4，使用血浆中MDM进行的早期原发性结直肠癌检测先导研究和MDM血浆结直肠癌监测研究的交叉验证模型的性能。A，每个患者组的监测数据集中出现结直肠癌的概率分布。B，复发结直肠癌MDM模型加CEA和不加CEA的ROC曲线与具有相应AUC和95%顺式的正常对照组相比。AUC，ROC曲线下面积。

讨论

在这项研究中，使用了新一代测序方法发现过的一种与原发性结直肠癌组织密切相关的新型MDM，我们评估了与转移组织来源的DNA相比，独立原发肿瘤组织中MDM的一致性。其次，对候选MDM采用具有高分析灵敏度的TELQAS分析方法来分析原发性结直肠癌的早期检测。这项技术随后被应用于独立的病例、疾病对照和健康对照，以验证在治疗时或治疗后检测患者复发结直肠癌的可行性。

最重要的是，研究结果表明，肿瘤特异性表观遗传学改变在原发性和转移性结直肠癌中是高度一致的，包括同步和异时转移，尽管在使用新辅助治疗或化疗后有可能进行克隆选择。随着时间的推移和接受治疗后，似乎有最小的表观遗传漂移现在。在MDM组织研究中，我们发现所选的14种MDM在左侧原发癌和转移性结直肠癌中的水平都是一致的。此外，与DNA突变的大型甲基化测量相比，对相对较小的交叉验证甲基化标记物的靶向分析似乎显示出在检测早期疾病或复发/转移疾病的潜在临床实用价值。虽然与健康对照组相比显示出高度的特异性，但专家小组预测，手术后无ED的患者中有近三分之一可能患有结直肠癌，这表明可能存在“微小残留病”。

MDM早期检测试点研究旨在探索晚期疾病的准确性，并据此选择可应用于监测研究的MDM临界值。应该进一步强调的是，血浆中MDM的初步研究并不代表筛查和早期检测的完全优化的检测方法，进一步的研究正在进行中。然而，很明显，这种目前形式的血浆MDM检测方法对IV期疾病的检测具有很高的准确性。以前的研究用相对较大的样本量前瞻性地评估了cfDNA中几种甲基化标志物的准确性，结果显示对I-IV期结直肠癌的敏感度在48%到90%之间。通过TELQAS分析，我们证明了多种新的MDM在疾病的所有阶段都有很好的准确性；我们还观察到随着期数的增加，敏感性不断增加，证实了肿瘤恶化与血浆cfDNA含量之间预期的正相关。然而，这些液体活检早期检测结直肠癌的观察结果应该谨慎看待。因为这项研究的病例对照设计不允许估计阳性预测值，可能会对敏感性估计产生偏差，特别是对早期疾病，而且I期病例的数量相对较少。

我们在复发/转移性结直肠癌方面的发现得到了其他文献的支持。甲基化的BCAT1/IKZF1和WIF1/NPY已被证明是结直肠癌手术切除后或辅助化疗期间优于CEA的预后标志物。在397例接受治疗后监测的结直肠癌患者中，甲基化的BCAT1/IKZF1预测结直肠癌复发的敏感性仅为68%(95%CI，48%~84%)。在这项研究中，原发结直肠癌和转移性结直肠癌中MDM水平的高度一致性和在检测原发结直肠癌方面的高准确性之后，我们在一组监测环境中没有原发结直肠癌的肠外复发/转移性结直肠癌患者的锁定模型中验证了血浆MDM测定的有效性。正如预期的那样，在高特异性界值下，无论有没有CEA，MDM都能够以更高的灵敏度检测复发/转移的结直肠癌，特别是在有肝或肺转移的患者，那些基于RECIST测量的肿瘤负荷大于4 cm的患者，以及那些左侧原发性结直肠癌的患者。这一模型的表现似乎很有效，尽管之前对原发性结直肠癌进行了治疗，或者存在正在进行的保守性化疗。

另一方面，这项研究的样本量有限，因为它是在前瞻性研究的背景下收集的血浆样本的横断面分析。我们的模型能够预测与健康对照组相比，非ED患者发生结直肠癌的可能性增加。但NED复发的患者数量仍然很低。为了进一步评估这些新型MDM在预测结直肠癌复发和检测“微小残留病”方面的能力，与目前的护理标准相比，需要更长的随访时间和足够数量的实验样板来排除NED患者的亚临床复发的干扰。

综上所述，MDM水平在原发性和转移性结直肠癌中高度一致。血浆检测从原发性结直肠癌中发现的新的结直肠癌相关MDM似乎能够可靠地检测早期结直肠癌，对晚期疾病具有极高的敏感性。同一模型中的这些血浆MDM也可以检测到远端复发/转移的结直肠癌，准确度令人满意。MDM在结直肠癌非侵入性治疗后监测和治疗监测中的临床应用值得在有充分随访的纵向研究中进一步评估。