精准医学：关于肝癌发生过程中DNA甲基化改变的研究｜预后监测

易点评
本研究作者从筛选候选表观遗传信息传递因子、评估肝硬化组织中甲基化改变的预后潜力这两个角度出发，对248名患者的390个组织样本进行了全面的全基因组DNA甲基化分析，涵盖了从正常肝组织、肝硬化、异常增生结节、初期肝癌和进展期肝癌的整个肝癌发生过程。进而，将DNA甲基化结果与基因表达数据整合发现，DNA甲基化可以准确区分肝癌发生过程中不同的组织学阶段，从而筛选出四个新的候选基因，它们是癌前病变向早期肝癌转变过程中的候选表观遗传学信息传递因子。本研究是通过全基因组甲基化分析筛选获得新型肿瘤预后标志物的典型研究案例。

背景
肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌最常见的形式，通常发生在慢性肝病患者中，主要是肝硬化。乙型肝炎(HBV)和丙型肝炎(HCV)病毒感染、酒精使用障碍（酒精依赖症）和非酒精性脂肪肝是主要病因。美国在2000至2016年间，肝癌死亡率上升了43%。在肝硬化的背景下，对导致癌变的分子机制的了解有限。DNA甲基化异常已被报道发生在许多肿瘤类型癌症早期。例如，在结肠癌中，DNA甲基化与启动子表观遗传沉默引起的微卫星不稳定性有关；在转录后控制蛋白质表达的microRNA的表达也可以在表观遗传上进行修饰；结肠癌的整体DNA低甲基化可导致染色体不稳定，促进恶性转化。而在HCC中，除了来自肿瘤的分子信号外，本文还识别了来自邻近非肿瘤性肝硬化组织的转录信号，这些信号与接受切除治疗的HCC患者的预后相关。并且从肝癌组织中发现了一个DNA甲基化信号，该信号与接受手术切除的早期肿瘤患者的存活率相关，具有预测存活率的能力。以前的研究已经分析了肝癌中DNA甲基化的变化，但对肝癌患者肝硬化或癌前病变中全基因组DNA甲基化的变化知之甚少。考虑到DNA甲基化对基因表达和染色体稳定性的贡献，作者假设了DNA甲基化的改变会促进肝脏的恶性转化。

方法
应用Illumina HumanMethylation450(485,000个CpG，占已知CpG岛的96%)进行甲基化分析，共获得来自248名患者的390个样本数据(246个先前报道和144个新分析的组织样本)：16个正常肝组织，139个肝硬化组织，8个异常增生结节和227个HCC样本，包括40个2 cm以下的eHCC（图1）。

图1.人群样本选择方案

结果

正常肝脏向早期肝癌转变的DNA甲基化异常改变

作者首先试图评估人类肝癌发生过程中全基因组DNA甲基化图谱的差异，根据不同DNA甲基化位点之间的欧几里得距离(n=421,997)构建的表观遗传关系树显示，正常组织是均匀线性聚集的；接近正常的肝硬化组织开始表现出一定的异质性；与正常肝组织相比，肝细胞癌的异质性最高；而异常增生的结节散布在肝硬化和肝癌组织中(图2A)。因此可以说正常肝脏、肝硬化组织、异常增生结节和最接近非典型增生的HCC之间的甲基化改变呈梯度变化，接着按组织类型进行了聚类分析（图2B）。在观察到区分正常肝脏和病变组织的显著的逐步甲基化变化之后，作者试图探索组织学类型之间的具体差异。每种情况(正常、肝硬化、异常增生和肝癌)之间的差异甲基化分析显示，肝硬化和肝癌之间的差异甲基化区域(DMR)数量最多；其次是正常和肝癌样本；而肝硬化、增生异常和正常组织样本的比较显示，其差异甲基化区域最少（图2C）。这与基因表达数据相似，在基因表达数据中，当比较HCC和癌前阶段时，发生改变的基因最多，而不是在癌前阶段或HCC阶段(早期和晚期)的比较中发生改变的基因最多。

图2.正常肝脏、肝硬化组织、异常增生结节和HCC之间的甲基化差异分析

肝癌发生过程中新的表观遗传学候选信息传递因子的鉴定

接下来作者试图确定肝癌早期转化过程中潜在的新型表观遗传学信息传递因子。从肝硬化组织(<1%的样本高甲基化)到发育不良结节(≥25%的样本高甲基化)和肝癌(≥50%的样本高甲基化)的甲基化水平逐步增加作为候选基因的挑选标准(图3A)。通过筛选确定了30个潜在的表观遗传信息传递因子，再进行进一步的与相应RNA表达数据整合发现TSPYL5(r=0.31)、KCNA3(r=-0.33)、LDHb(r=-0.46)和SPINT2(r=-0.43)的甲基化水平与基因表达呈显著的负相关(均P<0.001)(图3B)。

图3.肝癌发生过程中新的表观遗传学候选信息传递因子的鉴定

DNA甲基化识别肝硬化癌旁组织的临床相关亚型

考虑到邻近肿瘤组织的基因表达对预测肝癌风险和切除后生存率的作用，作者推测DNA甲基化的改变在这方面也起着一定的作用。具体地说，就是根据全基因组DNA甲基化的改变来评估肝硬化邻近非肿瘤组织是否存在不同的分子亚类。在本次研究中采用了130名来自邻近非肿瘤组织的DNA甲基化患者(肝硬化占94%）的组织样本。对其全基因组甲基化图谱进行了无监督聚类分析，通过分析识别出两个簇M1（有42%的患者）和M2（有58%的患者），结果显示这两个簇与生存相关(p<0.05)，与病因无关。这些发现表明，与基因表达分析相比，非肿瘤组织中可以通过捕捉早期肿瘤发生和肝脏恶化的DNA甲基化变化指标来更敏感地识别预后不良的肝癌患者。

图4.DNA甲基化识别肝硬化癌旁组织的临床相关亚型

整合DNA差异甲基化和基因表达分析

作者发现31,957个CpG位点(FDR<0.05)在肝硬化组织的M1和M2之间存在差异甲基化。图5A描绘了M1和M2组之间差异DNA甲基化的情况。这些结果表明M2中CD4+T细胞反应和分化途径的自噬和免疫激活增加，特别是因为与M1相比，该簇显示出较低的存活概率。此外，簇M1显示胆固醇代谢和神经活性配体-受体相互作用的甲基化减少。这与差异甲基化结果是一致的，表明了与M2相比，M1的胆固醇途径的甲基化减少，而免疫和炎症途径的甲基化增加。这些结果也与其他协变量进行了比较，如乙肝病毒、丙型肝炎病毒的存在和饮酒，但M1和M2之间没有显著差异。

图5.M1和M2组之间差异DNA甲基化的情况

结论
全基因组DNA甲基化图谱能准确区分人肝癌发生的不同组织学阶段。本文发现了从增生异常结节到eHCC发展过程中新的表观遗传学信息传递因子，以及肝硬化组织中的DNA甲基化改变与临床结果相关。

参考文献：
Hernandez-Meza G, von Felden J, Gonzalez-Kozlova EE, Garcia-Lezana T, Peix J, Portela A, Craig AJ, Sayols S, Schwartz M, Losic B, Mazzaferro V, Esteller M, Llovet JM, Villanueva A. DNA methylation profiling of human hepatocarcinogenesis. Hepatology. 2020 Nov 25. doi: 10.1002/hep.31659. PubMed PMID: 33237575.

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