组学前沿：从胆结石、异常增生到胆囊癌过程中甲基化变化的全表观组分析｜文献科普

易点评

胆囊癌（GBC）是一种高度侵袭性的胆道恶性肿瘤，对GBC的研究长期以来一直有限，为了弥补GBC研究上的不足，本文专门针对胆囊癌发生发展过程的表观遗传学变化进行了研究。作者建立了胆结石→异常增生→胆囊癌为代表模型样本，使用Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChips技术进行全表观组甲基化分析，识别了差异甲基化位点、区域和途径以及拷贝数变异(CNV)的变化，从而证实了表观遗传学改变的数量和程度随着疾病的发展而增加这一结果。这篇文章告诉我们，胆囊癌的发生包括三个主要的甲基化阶段：早期(胆结石和低度异常增生)、中期(重度异常增生)和晚期(GBC)。甲基化和CNV的逐渐变化有助于加深对这种侵袭性疾病潜在机制的理解，并最终达到改善治疗和早期诊断GBC的目的。

背景

胆囊癌(GBC)是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，每年影响全球超过17.5万人。胆囊癌在美国和西欧相对罕见，但在东南亚和南美洲的几个国家非常常见。因胆囊癌导致死亡的病例大多数发生在低收入和中等收入国家，因此对这种疾病的研究长期以来一直很有限。流行病学研究已经确定了几个GBC风险因素，包括胆结石(GSD)、炎症、毒素、种族和遗传背景等。其中GSD使GBC的风险大大增加，胆结石和胆囊癌之间的联系被认为是由于胆囊上皮的持续刺激，导致炎症和细胞再生，最终触发上皮细胞通过异常增生引发原位癌的出现，在这种癌中，细胞积累了大量基因组和表观基因组的改变，可能在5-15年内导致侵袭性胆囊癌的发生。深入了解伴随疾病进展的分子变化对于改善GBC的早期发现和治疗至关重要。然而，此前对GBC的大规模分子研究没有考虑癌前异常增生病变，或者没有研究整个表观基因组的甲基化变化。

为了弥补这一缺陷，作者收集了受GSD、低度异型增生、重度异型增生和GBC影响的智利患者的胆囊组织样本，用Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChips进行甲基化分析。这些数据使作者能够全面分析智利患者中GSD→异型增生→GBC的甲基化数据，还利用了EpiTYPER Massarray技术验证了作者的发现，通过RNA测序(RNAseq)和qRT-PCR研究了甲基化与基因表达的关系，并在GBC细胞系中进行了去甲基化实验，从功能上评估了甲基化对几个候选基因基因表达的影响。

方法
用Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChips分析从FFPE胆囊组织切片中提取的基因组DNA，进行全基因组甲基化分析。82个样本(胆结石n=32，低度异型增生n=13，高度异型增生n=9，GBCn=28)的预处理和质量控制数据可用于识别差异甲基化标记、区域和途径以及拷贝数变异(CNV)的变化。

结果
智利胆囊疾病患者群体的主要特征
为了研究GSD向GBC转化过程中的分子变化，作者收集了88例GSD患者(33例GSD，15例轻度异常增生，10例高度异常增生，30例GBC患者)的临床资料和胆囊组织标本，其中81例符合甲基化质量控制标准。作者观察到女性的比例高于男性(69名女性和12名男性)，更多的老年患者受到高度异型增生或GBC的影响，而非GSD或低度异型增生得影响(p值=5.1×10-5；图1A)。

在GBC发展过程中甲基化的总体差异
甲基化变异性标记的PCA显示GSD和低度异型增生样本具有总体相似的甲基化模式(图1B)。并且作者从GBC样本中分离出了GSD+低度异型增生，而高度异型增生样本正是介于两者之间。类似地，无监督聚类法能够相当准确地将GBC与其他样本区分开来，并将GBC组中的两个样本进行分类(图1C)。
除了评估甲基化的显著变化外，作者还使用以患者的年龄和性别为协变量的线性回归模型来分析甲基化水平(图1D)。聚类分析表明，GSD与低度异常增生之间的甲基化差异较小，与高度异常增生之间的差异较大，许多标记在GBC中表现出比GSD更大的差异甲基化效应。大多数差异甲基化标记在胆囊癌和高度异常增生中的甲基化程度高于GSD样本(图1D)。

甲基化改变的功能分析
为了更深入地了解在胆囊癌发生过程中观察到的甲基化变化，作者分析了已识别的甲基化标志物的功能元件。虽然Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip中的850k标记大多位于“公海”区域，但在GBC发展过程中甲基化逐渐变化的标记主要位于CpG岛(Fisher检验p值<2×10-16)(图1E)。平均而言，基因标记的甲基化程度低于转录起始点附近标记的甲基化程度(TSS1500 p值=5×10-63和TSS200 p值=8×10-142)，增强子的甲基化水平随GBC的进展而降低。
作者还进行了基于重要标记相邻基因的GO富集分析。GO分析确定DNA结合的转录因子具有特别丰富的分子功能。此外，差异甲基化还大量存在于涉及受体信号的通路中，包括Wnt和cadherin通路，这两个通路曾被认为与智利GBC的组织侵袭(细胞-细胞粘附)有关。综上所述，这些结果表明胆囊癌发生过程中的甲基化变化在功能上是相关的，并且对细胞-微环境通讯相关的基因有着相当大的影响。

候选基因分析

邻近CpG位点的广泛甲基化改变，特别是那些位于基因启动子和CpG岛上的位点，往往是功能性的。作者使用CHAMP R-Package计算CpG密度和甲基化变化，与GSD+低度异型增生样本比较，检测高级别异型增生和GBC合并GBC样本之间聚集的CpG位点的DMR。结果表明，Hedgehog信号的表观遗传调控可能会促使胆囊癌的发生。

作者还在WIF1、RUNX3和TP73(图2A)中检测到超甲基化的启动子，它们已被归类为肿瘤抑制基因，因此这可能与胆囊癌存在着特别的机制相关性。图2B-D显示了位于启动子区域(灰条)和基因(橙条)标记的DMR值分布。RUNX3转录因子在候选癌症基因中显示出最显著的启动子超甲基化(图2A)。TP73的甲基化图谱的复杂性更加明显，它包括两个可能有利于肿瘤促进或肿瘤抑制异构体转录的启动子区。作者在TP73启动子的CpG岛的TSS上游和编码区外检测到一个超甲基化区域(图2D)，它可能有利于肿瘤抑制异构体的表达。研究还表明，WIF1、RUNX3和TP73的甲基化随着肿瘤分级(图2E)和分期(SUPL)的增加而增加。

拷贝数分析
Infinium MethylationEPIC阵列提供了研究全基因组CNV的机会。按照GSD→低度异型增生→高度异型增生→GBC的顺序，每个样本的变异频率增加(p值=6.8×10-8，图3A)。这表明高度异型增生和胆囊癌的基因组不稳定性高于低级异型增生和胆结石样本，产生了更多的基因组异常(图3B-F)。最常受到影响的基因是肿瘤抑制基因CDKN2A和TP53，分别有8个(29%)和5个(18%)GBC样本基因组丢失(图3B，D)。因此，CNV结果说明针对GBC患者可以进行量身定制的联合治疗，并且经过进一步的机制分析有望寻找到成为癌症药物靶点的基因。

甲基化测量的验证，并研究甲基化与mRNA表达的关系

为了验证Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip识别到的甲基化差异，作者应用了基于PCR的EpiTYPER Massarray技术，并在可用的DNA样本(GSD n=10和GBC n=10)中定量了9个候选CpG标记的甲基化。研究结果显示基于表观基因组范围的EPIC和候选标记Massarray测量结果之间具有良好的总体一致性。

在每个疾病分期中，作者发现启动子甲基化与基因表达呈负相关，相关强度依次为GSD→低度异型增生→高度异型增生→GBC(图4A)。三个基因HAND2、Fezf2和EDNRB在GBC中的表达水平有所下降(图4B)。作者还观察到高甲基化基因APC(Wnt信号)、HHIP(Hedgehog信号)和ZSCAN18(图4C)的表达值降低，而低甲基化基因HMGA1和ERBB2的表达量增加。根据基于EPIC的CNV数据，MDM2和ERBB2在显示CN增加的样本中过度表达(图4D)。使用ERBB2 DC-CISH在两名患者中检测到的ERBB2增加的验证为作者的结果提供了额外的支持(图4E)。

去甲基化实验结果
为了进一步研究甲基化对基因表达的潜在因果影响，我们对GBC细胞系进行了功能分析。总体而言，甲基化的启动子区域显示出低表达值，包括高甲基化的候选基因，如CDO1、TP73、RUNX3、WIF1、TRIM58、ZNF177和ZSCAN18(图5A)。相反，已报道具有促肿瘤作用的GBC中的低甲基化基因(如YEATS4、WSB1、CDCA7、ANK1和HMGA1)在G-415中普遍表现出较低的启动子甲基化和较高的表达。

为了从功能上评估甲基化对某些候选基因表达的影响，我们用DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dC处理两个GBC细胞系(G-415和OZ)。图5B显示了β甲基化的值，图5C描绘了处理72h后CD01、RUNX3、TP73和HMGA1的表达水平。与对照组相比，5-aza-dC处理降低了两种细胞系中CDO1、RUNX3和TP73的甲基化，而HMGA1(在GBC中低甲基化)的甲基化没有改变(图5B)。因此，5-aza-dC处理导致CDO1和RUNX3在两种细胞系中的表达增加，通过减少DNA甲基化来支持转录抑制(图5C)。治疗后TP73甲基化水平降低，在G-415细胞中表达增加，而在OZ细胞中表达无明显变化。正如预期的那样，HMGA1表达的变化没有统计学意义。

参考文献：
Brägelmann J, Barahona Ponce C, Marcelain K, Roessler S, Goeppert B, Gallegos I, Colombo A, Sanhueza V, Morales E, Rivera MT, de Toro G, Ortega A, Müller B, Gabler F, Scherer D, Waldenberger M, Reischl E, Boekstegers F, Garate-Calderon V, Umu SU, Rounge TB, Popanda O, Lorenzo Bermejo J. Epigenome-wide analysis of methylation changes in the sequence of gallstone disease, dysplasia, and gallbladder cancer. Hepatology. 2020 Oct 5. doi: 10.1002/hep.31585. PubMed PMID: 33020926.