易基因｜精准医学： TERT启动子DNA甲基化在癌症中的双重作用

DNA甲基化是基因表达的重要调控机制，加拿大多伦多大学的Donghyun D. Lee团队从生物学和临床角度讨论TERT启动子DNA甲基化在肿瘤中双重作用的最新进展，相关结果发表在2021年11月的J Clin Invest（14.808）期刊上。

缩略词：

TERT：端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase）

THOR：TERT高甲基化肿瘤区域（TERT hypermethylated oncological region）

DAM：特异性等位基因甲基化（differential allelic methylation）

THOR-DAM：TERT高甲基化肿瘤区域特异性甲基化

TPM：TERT启动子突变（TERT promoter mutations）

ARMS-PCR：扩增突变系统PCR（amplification refractory mutation system PCR）

研究背景

端粒是染色体末端核蛋白结构，可维持基因组稳定性和预防癌症。而癌细胞可以通过激活端粒维持机制来复制肿瘤细胞，通过端粒酶逆转录酶 (TERT) 的异常表达来激活端粒酶是癌症最普遍的端粒维持机制。癌症TERT异常表达的特定驱动因素有很多，包括转录激活因子、TERT拷贝数变异、TERT启动子突变（TERT promoter mutations ,TPM）、启动子远端区域TERT高甲基化肿瘤区域（TERT hypermethylated oncological region,THOR）等，但这些因素如何在癌症中独立或合作地激活TERT异常表达仍未完全了解。

研究方法

作者收集了各种组织的575个肿瘤样本和77个正常组织样本（Table 1），进行基因组DNA/RNA制备、重亚硫酸盐PCR和NGS测序，对基因组DNA(100ng)进行重亚硫酸盐转化，使用不同的引物组对重亚硫酸盐转化DNA中的靶向扩增子进行PCR扩增（扩增子引物不与CpG位点重叠）。随后对测序reads进行比对和等位基因特异性甲基化(differential allelic methylation，DAM)分析，比较等位基因DNA甲基化模式。

 

Table1：General characteristics of the human tissue samples

THOR-DAM标准：[A1] 

1. 一个等位基因高甲基化 (>16.0%)，另一个等位基因低甲基化 (<16.0%)
2. 肿瘤样本低甲基化和高甲基化等位基因之间的平均甲基化差异大于 8.2%

ARMS-PCR：

鉴定启动子SNP（pSNP,rs2853669,A或G）与外显子SNP（exSNP,rs2736098,C或T）相关碱基。

ddPCR的相对TERT表达：

从每个组织或细胞系中提取总RNA，并将1μg总RNA逆转录为cDNA。使用数字液滴PCR（digital droplet PCR, ddPCR）分析每个cDNA样品（50ng），探针靶向相同的外显子SNP（exSNP，rs2736098），ddPCR结果通过Sanger对cDNA样品的测序得到双重确认。

报告基因表达分析：

使用单因素方差分析（1-way ANOVA）评估报告基因表达的显著性，Dunnett’s post hoc test进行多重假设检验矫正。

                                               

研究结果

癌症中的THOR-DAM富集

为了研究TERT启动子等位基因特异性DNA甲基化的存在，作者评估了10种不同癌症类型的575个肿瘤组织和77个正常组织样品，对THOR区域（Chr5:1295321-1295393，覆盖THOR区域的7个CpG位点）共同的单核苷酸多态性位点（rs2853669，启动子SNP或pSNP，Chr5:1295349，GRCh37/hg19）进行下一代测序（NGS）和reads比对。

其中286个肿瘤和34个正常组织含有杂合pSNP（含有“A”SNP或“G”SNP的等位基因），在所有肿瘤类型中“A”和“G”等位基因（δ甲基化）之间的甲基化差异分析结果显示：正常组织等位基因的甲基化差异不明显，平均差异为2.7%；癌症组织的平均等位基因甲基化差异更为显著，范围从脑膜瘤的3.0%到结肠癌样本的29.7%，“A”和“G”等位基因之间的高甲基化率无明显差异。与正常组织相比，结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、膀胱癌和胶质瘤等肿瘤类型的平均差异等位基因甲基化明显较高。

为定义和评估THOR-DAM，作者制定两个严格的标准：（a）一个等位基因高甲基化 (>16.0%)，另一个等位基因低甲基化 (<16.0%)；（b）肿瘤样本低甲基化和高甲基化等位基因之间的平均甲基化差异大于 8.2%。基于此标准，将肿瘤区分为THOR-DAM 和non-DAM，结果发现在正常组织中THOR-DAM很少被观察到（3%，1/34），而在肿瘤组织中则很常见（29.0%，83/286）。且THOR-DAM在不同癌症类型中非随机分布，发病时间短的肿瘤类型呈THOR低甲基化，而从低级（癌前）发展到高级（恶性）、发病时间长的肿瘤类型前期THOR一个等位基因高甲基化，导致高DAM率，进而导致THOR双等位基因高甲基化。

TERT启动子突变（TPM）高发于黑色素瘤、成人胶质瘤和膀胱癌，这些肿瘤表现出最大的平均等位基因甲基化差异和最高的THOR-DAM率（分别为53%，67%和60%）（图1，C和D），表明THOR-DAM可能在TPM中富集。

Figure 1：Prevalence of THOR-DAM in human cancer

TPM背景下的THOR-DAM

根据TPM状态将所有肿瘤样本分成两组（WT vs TPM）评估THOR-DAM率，结果显示TPM组的THOR-DAM率比WT组明显更高。作者通过分析神经胶质瘤亚群（n=21）中的单个测序read，进一步研究了THOR等位基因特异性甲基化水平，结果发现WT胶质瘤都表现出相似的等位基因甲基化模式，其中两个等位基因都低甲基化，表明近端THOR双等位基因低甲基化。而TPM胶质瘤存在非随机高甲基化。

Figure 2：Association between THOR-DAM and TPM in human cancer 

 

THOR-DAM和等位基因特异性TERT表达

为了研究THOR-DAM在TPM和non-TPM情况下对TERT等位基因特异性表达的功能影响，作者选取启动子（pSNP，rs2853669）和外显子2（exSNP，rs2736098）区域共11个癌细胞系（5个TPM和6个WT）（Table 2）的等位基因特异性甲基化特征（基于pSNP）与TERT表达（基于exSNP）进行关联模型。作者使用扩增突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）PCR确定pSNP（A/G，区分特异性甲基化）和exSNP（C/T，区分特异性表达）的特异性关联。结果显示除LnCAP外，所有细胞系均表现出TERT的单表达。

Table 2：General characteristics of the human cancer cell lines

使用靶向NGS测序评估核心TERT启动子（Chr5:1295313-1295395，GRCh37/hg19）和近端抑制性THOR（repressive THOR，rTHOR，Chr5:1295395-1295524，GRCh37/hg19）的等位基因特异性甲基化模式。结果显示在TPM癌细胞中，携带杂合TPM（黄线）的等位基因在核心TERT启动子内低甲基化，在远端rTHOR中高甲基化，平均甲基化水平为35%（图3A）；no-TPM等位基因（红线）在整个核心TERT启动子和rTHOR区域都被高甲基化，且无任何TERT转录激活。 

 

Figure 3：Allele-specific CpG methylation patterns of the TERT promoter in TPM and WT cancer cell lines.

TERT启动子DNA甲基化在癌症中的双重作用

最后，作者通过功能和机制实验进一步表明等位基因特异性高甲基化在TERT启动子中的双重作用。当与低甲基化近端核心启动子结合时，THOR高甲基化可增强TERT表达，而核心TERT启动子的高甲基化抑制了包括THOR高甲基化和TPM在内的激活变化。

Figure 5：Proposed model of epigenetic regulation of TERT in human cancer 

 

易基因小结

作者从10种癌症类型中筛选了大量正常组织和肿瘤组织（n=652），确定了THOR区域的差异等位基因甲基化（differential allelic methylation，DAM）仅存在于癌组织中。THOR-DAM在成人癌症中常见，且在含有激活性TERT启动子突变（TERT promoter mutations ,TPM）的肿瘤中富集。功能研究显示，在TPM和TERT WT癌症中，TERT的等位基因特异性基因表达需要核心启动子的低甲基化。然而，具有低甲基化核心TERT启动子的表达基因普遍表现出THOR高甲基化。总之研究结果表明，TERT启动子等位基因特异性DNA甲基化在调节癌症TERT表达中具有双重作用。

作者从生物学和临床角度论证了TERT启动子甲基化作为治疗靶点可防止癌细胞无限复制，从而抑制肿瘤复发。

参考文献：doi.org/10.1172/JCI146915

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