易基因：WGBS等多组学揭示磺胺类药物对水稻DNA甲基化和糖代谢的作用 | 作物育种

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抗生素因其在农业和工业中的广泛使用，以及大量暴露于环境中，导致抗生素成为主要的新兴污染物。磺胺类药物是使用最频繁的抗生素之一，它们在食物样本中被频繁检测到。DNA甲基化是解开基因组和环境暴露之间复杂互作的桥梁，其变化调节了细胞对污染物的代谢响应。然而，污染物胁迫下位点特异性DNA甲基化异常和代谢紊乱的机制仍然难以捉摸。

2024年5月10日，浙江大学环境与资源科学学院朱利中院士团队以水稻（Oryza sativa L.）为模式植物，选择磺胺嘧啶（SD，sulfadiazine，嘧啶环上无甲基）及其同源磺胺甲基嘧啶（SD1，sulfamerazine，有一个甲基）作为代表性污染物，研究磺胺类药物对水稻表观遗传变异的影响，以及外源性甲基对DNA甲基化的结构效应影响。通过对甲基化组学（methylomics）、转录组学（transcriptomics）和代谢组学（metabolomics）等多组学综合分析，鉴定出磺胺类药物胁迫下DNA甲基化调控的关键代谢通路。研究从表观遗传学角度深入理解污染物诱导代谢毒性的潜在机制，为评估有机污染物的毒性和管理其环境风险提供有价值的见解。相关研究成果以“Sulfonamide-induced DNA hypomethylation disturbed sugar metabolism in rice (Oryza sativa L.)”为题发表在《Environment International》期刊上。

标题：Sulfonamide-induced DNA hypomethylation disturbed sugar metabolism in rice (Oryza sativa L.) 磺胺诱导的DNA低甲基化干扰水稻（Oryza sativa L.）的糖代谢

时间：2024.5.10

期刊：Environment International

影响因子：IF 11.8 / 1区

实验方法：WGBS、mRNA-seq、代谢组、体外实验等

研究摘要：

本文系统评价了农田土壤中普遍存在的一组抗生素磺胺类药物（即磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶）在 1 mg/L 水培暴露 14 天对水稻的多组学干扰。代谢组和转录组分析显示，57.1-71.4%的单糖和二糖被积累，差异表达基因参与促进糖水解以及磺胺类药物的解毒。大多数差异甲基化区域 (DMR) 是低甲基化区域（占 87-95%），其中 92% 位于CHH背景中（H = A、C 或 T 碱基）。 KEGG富集分析显示启动子区的CHH-DMR在糖代谢中富集。为了揭示CHH的显著低甲基化，采用多光谱和热力学方法，结合分子模拟研究不同序列背景下磺胺类药物与DNA之间的分子相互作用，结果表明磺胺类药物会插入DNA的小凹槽中，与 CG 或 CHG 背景相比，与 DNA 的 CHH 背景表现出更强的亲和力。 DNA 3D 结构的计算模型进一步证实，在CHH环境中，结合导致间距增加0.1Å，DNA扭曲角减少3.8°。这种特定的相互作用和甲基转移酶 CMT2 (log2FC = -4.04) 下调抑制了 DNA 甲基化。这些结果表明基于DNA甲基化的评估有助于代谢毒性预测和健康风险评估。

图形摘要

研究方法：

实验设计：对水稻进行为期14天的水培实验，使用1 mg/L的磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶溶液处理。实验设置三个生物学重复。

代谢组和转录组分析：发现57.1-71.4%的单糖和双糖积累，差异表达基因参与促进糖水解和磺胺类药物解毒。

DNA甲基化分析：大多数差异甲基化区域（DMRs）呈现低甲基化状态（占87-95%），其中92%位于CHH序列背景中（H=A、C或T碱基）。

分子互作研究：使用紫外-可见吸收光谱（UV–vis）、圆二色谱（CD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）光谱学、等温滴定量热法（ITC）和分子模拟等技术，研究不同DNA区域与磺胺类药物之间的相互作用，以阐明DNA甲基化的序列特异性偏好。结果显示磺胺类药物倾向于插入DNA的小凹槽中，且对CG或CHG序列背景的亲和力更强。

计算模型：DNA三维结构的计算模型进一步证实。

结果图形：

（1）磺胺类药物对水稻的毒性作用

图1：水稻植株的生理生化分析。将水稻种子暴露于SD、SD1或去离子水作为对照。DNA甲基化、H2AX、ROS和地上生物量（六株幼苗的干重）水平表示为平均值±SEM（n=3）。*和**表明与对照组相比有显著差异（p<0.05和p<0.01）。

（2）水稻对磺胺类药物的转录组学和代谢反应

图2：水稻叶片代谢组和转录组的KEGG通路分析。将水稻种子暴露于1mg/L SD、1mg/L SD1或去离子水作为对照。

（A） 代谢分析。圆圈的颜色梯度表示统计学意义，圆圈的大小与通路内受影响的代谢物的百分比成正比。标记了显著富集通路，通路影响值>0.1，p<0.05。

（C，D）DEG前5个富集的KEGG通路转录组学分析。条形图颜色梯度表示统计学意义，红色标记通路为糖代谢。

（3）水稻在磺胺类药物胁迫下的DNA甲基化

图3：水稻叶片DNA甲基化组的生物信息学分析。这项分析在将水稻幼苗暴露于 1 mg/L 的磺胺嘧啶（SD）、1 mg/L 的磺胺甲基嘧啶（SD1）或去离子水（对照组）之后进行。

1. 在不同的序列背景（CG、CHG 和 CHH）中，高甲基化/低甲基化差异甲基化区域（DMRs）数量。这显示不同DNA序列背景下甲基化水平变化。
2. 不同基因组特征中的DMRs，包括启动子区域、gene body (5′ UTR、3′ UTR、外显子和内含子）以及其他区域（远端基因间区域）。揭示基因组中不同功能区域的甲基化变化。
3. 使用维恩图（Venn diagram）分析不同处理条件下的启动子CHH DMRs的重叠情况。鉴定不同磺胺类药物处理下共有或特有低甲基化区域。
4. 对共有的启动子CHH差异甲基化基因（DMGs）进行KEGG富集分析。使用颜色梯度来表示统计显著性，圆圈的大小代表在特定代谢通路中差异基因的数量。

图4：水稻叶片与糖代谢相关的多组学变化。将水稻种子暴露于1mg/L SD、1mg/L SD1或去离子水对照后进行分析。热图描绘了启动子DNA甲基化和基因表达之间的关联，行代表DMG和DEG共有基因。从紫色（-0.2，低甲基化）到黄色（0.2，高甲基化）的颜色梯度代表差异甲基化水平差异，从蓝色（-2，表达下调）到红色（2，表达上调）代表log2FC水平。

（4）DNA与磺胺类药物的相互作用

图5：磺酰胺类药物诱导的DNA结构变化。

（A）磺胺类药物与DNA结合时的热力学参数比较。

（B） DNA与SD结合的姿态（小凹槽结合）和结构偏差（绿色，条形图）。中间图显示了DNA（米色）和DNA-SD复合物（绿色）的结构重叠，链间距离以Å表示。两个正交视图突出了CHH位点的结构偏差，即碱基的六元环之间距离（黄色虚线，用黑色表示）和氢键长度（红色虚线，用深蓝色表示）。

（C） SD和CHH相互作用的量子化学计算结果。梯度等值面的代表图像，减少密度梯度（δginter/intera）与电子密度（ρ）和第二个Hessian特征值（λ2）的乘积的对应图。根据符号sign（λ2）ρ值（范围−1.0至1.0 a.u.）进行蓝绿-红色的颜色编码。分子之间的蓝色和绿色区域分别表示吸引力（氢键）和范德华力。

研究结论：

本研究揭示了磺酰胺的特异性结合诱导的DNA去甲基化及其在干扰水稻下游糖代谢中的作用。在GS和GTs的启动子区域中，CHH环境似乎最容易受到低甲基化的影响，因为它与有机污染物相互作用。凹槽结合和氢键的结合相互作用改变了相邻DNA双链体的几何形状，随后抑制了CHH甲基化过程。本研究为有机污染物诱导的DNA甲基化位点异常修饰和糖代谢紊乱提供了有价值的见解。加强对环境污染物引起的代谢破坏的分子机制的理解，对于鉴定具有潜在表观遗传毒性和遗传毒性的化学品至关重要，更重要的是，对于通过表观遗传策略管理和减轻污染物对作物质量的不利影响至关重要。未来的研究应该探索各种污染物在相互作用中诱导的差异甲基化的其他潜在影响。例如，污染物的生物转化产物可能充当外部甲基供体，影响体内甲基化过程并导致DNA甲基化变化。此外，修饰的DNA甲基化模式与紊乱的转录和代谢反应有关，并且可以在长期胁迫下通过种系传播进行转基因遗传。因此，未来的研究将侧重于阐明DNA甲基化的甲基化起源，并研究在存在污染物的情况下甲基化模式的遗传性。

关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

• 全基因组甲基化图谱课题
• 标志物筛选课题
• 小规模研究课题

技术优势：

• 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
• 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
• 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900.

参考文献：

Shao Z, Chen J, Wang S, Wang W, Zhu L. Sulfonamide-induced DNA hypomethylation disturbed sugar metabolism in rice (Oryza sativa L.). Environ Int. 2024 May 10;187:108737. pii: S0160-4120(24)00323-4. doi: 10.1016/j.envint.2024.108737. PubMed PMID: 38735075.

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