揭秘纳米抗体：羊驼的免疫奇迹

羊驼免疫制备纳米抗体技术是一种创新的生物科技应用，旨在利用羊驼独特的免疫系统产生高度特异性的纳米级抗体。该技术基于对传统IgG（免疫球蛋白G）结构的深入理解而发展起来，后者由两条重链和两条轻链组成，并通过其可变区实现对特定抗原的高特异性识别。VH区（位于重链上）与VL区（位于轻链上）共同构成了传统抗体识别抗原的关键部分，它们的序列多样性使得每种抗体能特异性地绑定不同的抗原。相比之下，CL区及CH区的恒定部分则负责维持抗体结构的稳定性以及介导免疫效应功能，如促进吞噬细胞或自然杀伤细胞等免疫细胞的活性。

通过模拟自然界中羊驼体内产生的天然纳米抗体特性，科学家们能够设计出具有更小尺寸、更好渗透性和更低生产成本的新型治疗性分子工具。这些纳米抗体不仅保留了高特异性结合目标抗原的能力，还克服了全尺寸IgG在组织穿透能力方面的局限性，为多种疾病提供了更加精准有效的诊断和治疗手段。随着研究的不断深入，羊驼源纳米抗体正逐渐成为生物医药领域内一个极具潜力的方向之一。

重链抗体是一种在自然界中，特别是驼类和软骨鱼类中发现的特殊免疫蛋白。它独特地仅由两条重链构成，缺乏传统抗体中的轻链和CH1区，但包含一个重链可变区（VHH）以及两个CH2与CH3恒定区。这种结构使得重链抗体能够通过其单一的VHH区域直接结合抗原，展现出与传统四链抗体相似的抗原识别功能。VHH的独立性允许其在体外稳定存在，这一特性使其被称为驼类单域抗体或纳米抗体。纳米抗体以其微小尺寸（晶体宽约2.5纳米，长约4纳米，分子量仅为传统完整抗体的十分之一，即大约15kDa）和高效的抗原识别能力而著称。它们通常通过噬菌体展示技术筛选获得VHH序列。得益于其紧凑的结构、强大的抗原识别能力和成熟的噬菌体筛选技术，纳米抗体可以高效地进行体外重组表达并大规模生产，有效克服了传统抗体生产过程中常见的批次间差异问题，为生物医学研究和治疗提供了一种强有力的工具。

纳米抗体以其较小的分子量和简单的结构，在新型药物研发中展现出显著优势。这些优势包括更高的靶点结合特异性、增强的组织穿透能力、出色的热稳定性以及适合大规模工业化生产的特点。此外，纳米抗体更易于改造和优化，并具有较好的人源化潜力，这使得它们成为众多研究机构和药物企业关注的焦点。与传统单克隆抗体通过杂交瘤技术制备不同，纳米抗体的开发通常涉及免疫羊驼、构建噬菌体文库以及利用噬菌体展示技术筛选候选者。随后，通过表达和纯化纳米抗体进行与抗原结合的验证实验来确认其有效性。

在当前研究中，获得单域抗体的普遍方法是通过免疫羊驼，利用其体内免疫系统产生成熟抗体。这一过程涉及多个关键步骤，包括从羊驼体内分离B淋巴细胞，提取RNA并进行反转录以合成cDNA。随后，以cDNA为模板，通过聚合酶链反应（PCR）扩增获取多样化的纳米抗体基因片段。这些基因片段被连接到噬菌粒上，构建成噬菌体库。接着，利用噬菌体展示技术从羊驼抗体库中筛选出最适宜的抗体，并对筛选出的纳米抗体进行验证。整个流程涵盖了羊驼免疫、噬菌体文库构建、抗体筛选、表达纯化及验证等阶段。

图1：羊驼免疫流程

（Generation Process of Nanobody - KMD Bioscience-Nanobody Discovery Platform, Protein Expression Systems, and CRO Service Supplier）

免疫羊驼所用的免疫原包括：

（1）蛋白质免疫原：这类免疫原通常由完整的蛋白质或重组蛋白片段构成，能够有效模拟天然条件下的抗原表位，激发强烈的免疫反应，从而诱导产生具有高亲和力和特异性的纳米抗体。

（2）小分子免疫原：这类分子的分子量通常低于1 kDa，由于其分子量较小，本身不足以激发免疫系统的响应。因此，需要通过与较大的载体蛋白质偶联来增强其免疫原性，从而促使免疫系统能够有效识别和反应。

（3）多肽免疫原：由短链氨基酸构成，这些多肽可以是线性或具有特定构象的，常用于模仿蛋白质抗原的局部表位。为了提高其稳定性和免疫原性，需要进行适当的设计和改造，以确保其能够在免疫应答中发挥预期作用。

（4）病毒免疫原：这些免疫原是从病毒中提取的特定蛋白或完整的病毒颗粒。它们能够激发宿主的免疫响应，但通常是灭活的，不会引起疾病，同时足以让宿主的免疫系统产生有效的防御机制。

（5）DNA免疫原：通过合成目标蛋白的编码DNA序列来制备，DNA免疫原的优势在于可以精确控制蛋白的编码序列，从而实现对特定抗体产生的调控。此外，这种免疫原的制备过程相对简单，成本效益较高。

（6）RNA免疫原：对于研究特定的RNA亚型及其转录后修饰非常有效，但其主要挑战在于难以保持其稳定性，且操作过程较为复杂，这限制了其在实际应用中的广泛使用。

细胞系类型免疫原是一种以细胞系作为免疫原的方法，通常通过表达目标蛋白的细胞系来产生抗体。在免疫过程中，选择健康强壮、精神状态良好、体型适中的未免羊驼即空白羊驼是关键。同时，确保免疫抗原的纯度及其正确构象对于后续筛选合适的抗体至关重要，蛋白抗原纯度一般至少不低于90%。淋巴细胞的分离也是重要的一步，及时的细胞分离可以有效阻止血液采集后的溶血，以达到最佳的分离效果。此外，免疫周期的选择也会影响免疫效果，根据经验，1-2周的免疫间隔可以使羊驼对大部分抗原产生良好的免疫反应。

参考文献

[1] Cortez-Retamozo V .Efficient Cancer Therapy with a Nanobody-Based Conjugate[J].Cancer Research, 2004, 64(8):2853-2857.DOI:10.1158/0008-5472.CAN-03-3935.

[2] Meyer T D , Muyldermans S , Depicker A .Nanobody-based products as research and diagnostic tools[J].Trends in Biotechnology, 2014, 32(5).DOI:10.1016/j.tibtech.2014.03.001.

[3] Steyaert J , Kobilka B K .Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states.[J].Current Opinion in Structural Biology, 2011, 21(4):567-572.DOI:10.1016/j.sbi.2011.06.011.