Edman降解法耦合过程
Figure 1.多肽的Edman降解蛋白N端测序
异硫氰酸苯酯(PITC)在多肽链的N端与a-氨基(或在脯氨酰残基带有亚氨基的情况下)进行反应,形成末端残基的苯硫代氨基甲酰基衍生物。Edman降解法最初使用吡啶来生成pH值为8.6的碱性环境,后来用的的替代品包括“Quadrol”、三甲胺和N-甲基哌啶。然而Edman降解法需要游离的α-氨基,如果氨基已经被修饰将不能与PITC反应,那么该多肽就相当于是“封闭的”(例如,许多蛋白质就被乙酰基、甲酰基或焦谷氨酰基团封闭)。例如,微量的非离子型洗涤剂即会引起末端封闭。另外,肽本身可能根本不具有N端:如环状天然肽,环孢菌素。在没有游离N端的情况下,必须通过化学或酶促方法切割多肽以产生具有游离N端的片段。需要注意避免样品被含胺的非肽类物质(如trizma碱)污染,因为这些物质也可能与PITC反应并生成干扰后续分析的产物。PITC还会与水和一些难以在反应中被完全排除的其他分子发生反应,因此试验中总会发现一些副产物,例如二苯硫脲。尽量减少副反应有助于提高化学反应和后续分析的效率。与过去的手动测序法相比,