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RSS订阅原创 Edman降解蛋白测序法的基本步骤解析：耦合和裂解过程
Edman降解法耦合过程Figure1.多肽的Edman降解蛋白N端测序异硫氰酸苯酯（PITC）在多肽链的N端与a-氨基（或在脯氨酰残基带有亚氨基的情况下）进行反应，形成末端残基的苯硫代氨基甲酰基衍生物。Edman降解法最初使用吡啶来生成pH值为8.6的碱性环境，后来用的的替代品包括“Quadrol”、三甲胺和N-甲基哌啶。然而Edman降解法需要游离的α-氨基，如果氨基已经被修饰将不能与PITC反应，那么该多肽就相当于是“封闭的”（例如，许多蛋白质就被乙酰基、甲酰基或焦谷氨酰基团封闭）..
2020-07-24 09:54:34
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原创 基于MS强度或计数的数据依赖法非标记定量蛋白质组学的蛋白质互作分析（一）
文章我们介绍了运用非标记定量蛋白质组LabelFree技术研究蛋白互作的背景，接下来我们将分几期，陆续给大家介绍具体的研究方法。本期要介绍到的是基于MS强度或计数的数据依赖法非标记定量蛋白质组学的蛋白质互作分析。在试验中使用不同的同位素标记（某些情况下等压标记）是一种行之有效的肽和蛋白质定量方法。通常，分析之前，标记样品和未标记样品是混合在一起的，这时可以通过测量相应的峰值强度来直接确定化合物比率。标记大致可以分成这些共价附着在肽上的标记，包括同位素编码的亲和标签、ICAT或iTRAQ、通过酶反应合成（
2020-07-17 14:31:31
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原创 基于质谱的蛋白质鉴定，第3节：基于MALDI-MS肽指纹图谱的蛋白质质谱鉴定
自从将质谱（mass spec, MS）引入蛋白质分析中以来，肽指纹图谱（peptide mass fingerprint, PMF）分析已成为高通量蛋白质鉴定的首选方法。在肽指纹图谱PMF分析方法中，来自二维凝胶电泳纯化的目标蛋白质，无论是通过酶水解还是化学裂解，最后都是通过质谱技术对所得的肽混合物进行分析。分析得到的肽指纹图谱与通过理论裂解数据库中存储的蛋白质序列而获得的无指纹图谱进行比较，检索得分最高的蛋白质作为可能的候选蛋白质。与其他电离技术（如ESI）相比，MALDI可以容纳分析物混合物中适度的缓
2020-07-10 10:13:35
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原创 科普│串联质谱分析仪（ESI离子源）之离子阱质谱仪
在蛋白质组学分析中，与ESI离子源配对的常用串联质谱仪有三种，三重四极杆（通常称为“三重四极”）、离子阱和四极飞行时间（Q-TOF）。小编这里给大家介绍一下其中的一种——离子阱质谱仪。离子阱质谱仪的设计和操作与三重四极杆质谱仪有很大的不同。离子阱收集和储存离子，然后对其进行质谱分析，而三重四分杆是在肽离子通过分析仪时对其进行质谱分析。该分析仪的设计非常简单。来自离子源的离子被引导到离子阱中，离子阱由顶部和底部电极和中间的环形电极组成（如图1A）。这个陷阱本身只有葡萄柚那么大。陷阱中收集的离子通过直.
2020-07-02 15:01:20
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原创 蛋白质降解技术中常用的蛋白酶（一）
蛋白质谱分析前通过蛋白质降解技术对样品进行降解常用到的几种蛋白酶及其裂解特性如下表：胰蛋白酶胰蛋白酶是蛋白质谱分析中应用最广泛的蛋白酶。胰蛋白酶主要从猪或牛胰腺中获得，且易于纯化。用甲苯磺酰基-L-氨基联苯氯甲基酮（TCPK）对其进行改性，可以抑制糜蛋白酶的残留。胰蛋白酶一般在赖氨酸和精氨酸残基处对蛋白质进行裂解，除非这两种残基中的任意一种在C-末端方向上接的是脯氨酸残基。赖氨酸和精氨酸残基在许多蛋白质中的间距使得所得到的多数肽的长度都适用于质谱分析。这种“双重专一性”意味着胰蛋白酶能比仅切割一
2020-07-02 14:59:51
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原创 基于MS强度或计数的数据依赖法非标记定量蛋白质组学的蛋白质互作分析（二）
本期接着上期内容，继续给大家介绍基于MS强度或计数的数据依赖法非标记定量蛋白质组学的蛋白质互作分析。通过对MS1扫描中检测到的信号强度的面积进行测量可以获得定量信息：目标物质的质量可从时间域中提取，从而生成提取离子色谱图（XIC），可用于整合目标化合物的LC洗脱峰。这一方法类似于处理SILAC数据的方法，它可确定同位素代码对的谱峰强度。这些基于MS1的非标记方法和同位素标记方法的主要区别在于，前者必须通过结合保留时间标记或重新调整保留时间数据的算法来密切管理LC中的保留时间。使用LC系统也可以进行.
2020-06-28 14:40:25
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转载 MALDI成像质谱中的蛋白质鉴定策略简介（四）
本节继续就MALDI成像质谱工作流程中的蛋白质提取策略进行整理。MALDI成像质谱法化学衍生化蛋白提取化学衍生化对存在于组织表面的分析物进行修饰，以增强靶标蛋白的分析特性，如灵敏度和碎片效率等。化学衍生化法可应用于小分子分析物的研究，以提高具有低电离效率的物质的敏感性。有许多研究已经使用蛋白质的化学衍生法简化从自下而上的MALDI数据集生成的片段化数据。如在MALDI TOF/TOF实验过程中的N末端衍生化方法，几乎只产生y型序列离子。N末端衍生化是通过使用磺化剂3-磺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯（3-SB
2020-06-09 15:41:19
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转载 蛋白互作常用的研究方法
蛋白质是生物功能最直接的执行者，虽然一些蛋白质可以独立的完成他的使命，但是大部分的蛋白都是需要一些伴侣分子的协助一起完成任务或者形成复合物之后才能充分发挥他的功能。所以，了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用，能够帮助我们更好的了解细胞的生命活性，揭示隐藏在表象下的调控机理。经典的蛋白互作研究方法主要包括三个：酵母双杂交、免疫共沉淀、GST-pull down。酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白...
2020-03-16 21:43:47
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转载 基于Edman降解的蛋白质测序法的用途详解
在过去的几十年，蛋白质序列测定的目的已经发生改变。其最初目的是确定蛋白质的全部或部分序列，以便更好地了解其结构和功能。分子生物学的出现提供了另一种更快速的方法，即通过对相应基因的测序来实现。设计寡核苷酸探针（用于基因克隆过程）和确认分离出的克隆确实是相关的部分都需要部分蛋白质序列。随着全基因组测序的发展，我们离获知所有基因（也可以说是所有蛋白质）序列的不远了。然而，就目前我们对基因序列的了解，并不...
2020-03-10 18:50:42
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转载 Edman降解法测序的发展史
Edman测序法是一种较早投入使用的测定多肽一级结构或序列的方法。20世纪中叶，人们已经知道蛋白质是由氨基酸组成的，但并不了解这些氨基酸是如何链接在一起的，是以相似残基的形式排列？还是随机混合在一起？又或者是其他组合方式？于是，科学家们设计了一系列的验证方法，很好地解决了这些疑惑：每个蛋白质都有其组成的氨基酸残基，它们以独特的顺序或序列线性排布。Sanger团队通过表征一系列由母体分子裂解产生...
2020-03-04 18:32:39
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空空如也
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