【文献速递】把基因“剪”成环：minigene如何揭开circRNA生成的秘密？

如果说mRNA是细胞里的“快递小哥”，那circRNA（环状RNA）就像“永生胶囊”——没有首尾，结构稳定，功能神秘。它们从哪里来？什么时候会被“剪”成环？又受哪些因子调控？2017年12月，Molecular Cell上线了一篇来自宾夕法尼亚大学Wilusz团队的研究，用minigene技术，首次系统揭示了“当pre-mRNA剪接机器掉链子时，细胞会把更多基因输出转向circRNA”。今天，我们就借这篇文章，带大家看看minigene技术如何成为circRNA剪接研究的“神器”。

01 研究背景

circRNA由前体mRNA“反剪接”（backsplicing）产生，即下游5′剪接位点回头与上游3′位点相连，形成共价闭环。虽然高通量测序告诉我们人类75%以上基因都能产生circRNA，但它们的丰度通常不足对应线性mRNA的10%。于是问题来了：circRNA水平到底受什么控制？是“生成慢”还是“降解慢”？Wilusz组猜测，答案藏在“剪接机器”本身——当核心组分稀缺或被抑制时，细胞会不会把“备胎”circRNA当成主要输出？

图1 经典mRNA剪接与反向剪接（backsplicing）存在竞争（Liang et al., 2017）。

02 实验设计思路

把E1-Intron1-E2-Intron2-E3克隆到铜诱导pMT启动子下，E2内插入XmaI位点作身份标记，两侧反向DNAREP1_DM重复碱基配对拉近空间距离，迫使剪接机器在“正剪接”生成线性E1-E2-E3 mRNA与“反剪接”生成514nt circRNA之间二选一。通过铜离子精确开关转录，Northern一次跑胶即可同时定量两种产物。

03 结果解读

图1A：正剪接vs反剪接同台竞技。绿色“发夹”代表一对反向DNAREP1_DM转座子重复序列，可像拉链一样把两个内含子拉近距离，促进反剪接。

图1B：14 h铜诱导后，circRNA条带亮度竟高于线性mRNA。

图1C：诱导0–8 h取样发现，2 h时线性mRNA已清晰可见，而circRNA几乎检测不到；8 h时两者相当。说明backsplicing初始效率远低于canonical splicing。

图1D：3h诱导后洗掉铜离子（BCS终止转录），线性mRNA约2 h减半；circRNA 24 h仍保持一定量。

图2 minigene技术验证Laccase2基因的反向剪接（Liang et al., 2017）。

参考文献

Liang D,Tatomer DC, Luo Z, et al. The output of protein- coding genes shifts to circular RNAs when the pre-mRNA processing machinery is limiting[J]. Molecular cell, 2017,68(5):940-954.e3.