【论文阅读】DeepContact:基于电子显微镜成像的MCS高通量量化

• 论文：《DeepContact: High-throughput quantification of membrane contact sites based on electron microscopy imaging》
• Github：https://github.com/LX-doctorAI1/DeepContact

摘要

膜接触点（MCS）介导的细胞器间的相互作用在细胞中发挥着重要作用。对MCSs的定量分析揭示了在各种生理和病理条件下细胞反应。然而，目前还缺乏一种有效的定量分析工具，在这种背景下，作者就开发了DeepContact，一种用于优化细胞器分割和接触分析，基于无标签EM的深度学习协议。
DeepContact在交互式可视化方面具有高效率和灵活性，能适应细胞器的新形态，并能识别多种宽度范围内的接触，从而能对多个系统中各种类型的MCS进行统计分析。DeepContact 分析了在综合营养条件下培养细胞中以前未发现的 MCS 协调重排类型。DeepContact 还揭示了在精原细胞周期中 Sertoli 细胞中 ER-线粒体缠结的微妙变化，显示了它在将MCS 动态与生理和病理过程联系起来方面的潜力。

Introduction

细胞器之间的精确协调对于细胞作为一个功能单元的运行至关重要，越来越需要阐明 MCS 在各种生理和病理条件下的确切作用。

EM可获取亚细胞内容物的超分辨率景观图像，以纳米级细节呈现细胞器及其相互作用的最直接形态信息。EM 图像的定量分析为 MCS 参与特定细胞事件提供了重要线索。然而，基于人工标注的细胞器分割耗费大量人力，而且在定义细胞器参数时存在偏差，它依赖于足够的成像分辨率和细胞器边界的准确确定。此外，精确的 MCS 分析需要高通量系统，以考虑不同样本之间的差异。

目前已开发出深度学习方法来识别EM图像中的细胞器，大多是一次识别一个细胞器。EM 成像技术和计算资源的进步使得基于深度学习的MCS三维分析成为可能，这种分析基于高分辨率容积数据中的细胞器分割，EM 成像需要数天的机器时间，而分析单个细胞则需要高性能计算资源。然而，生物样本的跨样本比较很容易因细胞的异质性而变得复杂，基于深度学习的统计分析需要较大的样本量，这在现阶段很难适应三维分析对时间和资源的需求。（总结：现阶段的三维分析要求较高）

我们设计了基于模型优化的单个细胞器精确分割的深度学习 MCS 分析协议 DeepContact，具有高效率和灵活性，可适应各种 EM 样本中不同类型和形态的细胞器。该系统可自动处理二维EM切片，在多种宽度范围内分割和可视化 MCS，并量化大量样本中的归一化 MCS 参数，从而实现各种生物过程中的跨样本接触分析。该系统在培养细胞和组织样本中的特定细胞类型中都得到了验证，揭示了不同生理环境下 MCS 剖析的前所未有的吞吐量和细节。通过可计算的设置，我们的开创性工作为体外和体内 MCS 的高通量统计分析提供了一种高效而全面的方法。

Result

Design of DeepContact

为了自动分割细胞器，并通过定义细胞器胞浆面之间的距离（接触宽度）计算其 MCS，我们利用EM图像建立了一种基于深度学习的方法。我们首先通过分析内质网-线粒体（ER-Mito）接触来演示该程序（图 1）。

DeepContact 工作流程。大图像由 EM 采集。我们通过一系列操作（包括调整大小、裁剪、仿射变换和归一化）对该图像进行预处理，以获得标准尺寸为 1,024 × 1,024 像素、分辨率为 10 纳米的用于分析的斑块。我们采用 fScore loss、IoU loss、Dice loss 和 BCE loss 训练 ER 分割模型，采用相似性 loss、最高似然损失、CE loss、边界框回归损失和掩码 IoU loss 训练线粒体分割模型。ER分割模型的输出是整个ER区域。线粒体分割模型的输出是所有线粒体实例。计算并报告线粒体的数量、周长、面积、比率和 MCS 轮廓。MCS 轮廓包括以不同颜色表示的 1-10 像素宽度间隔的长度和比率。比例尺为 2 μm。

EM图像可以是不同的尺寸和分辨率。为了规范高分辨率图像的分析过程，降低高分辨率图像的计算成本，首先对图像进行预处理，提取感兴趣区域(RoI)并将其调整为标准尺寸的1024 × 1024像素块，分辨率为10 nm;然后，对图像进行灰度归一化处理。

在训练阶段，我们使用滑动窗口协议以512像素步长提取1024 × 1024像素的图像块，并对每个图像块进行仿射变换和高斯模糊以生成训练样本。然后，这些样本被用于训练DeepContact模型。在图像级别上分割ER可能有助于对ER的整合模式进行建模，并从模型中排除其他池状细胞器网络，特别是高尔基体。因此，我们测试了几种语义分割模型，包括U-Net (Ronneberger et al.， 2015)、LinkNet (Chaurasia and Culurciello, 2017)、FPN (Lin et al.， 2016)和PSPnet (Zhao et al.， 2016)，表S1总结了它们的性能。DeepContact采用U-Net (Ronneberger等人，2015)作为ER分割的主干，因为它在Dice和平均交并比(mIoU)指标上都取得了最佳性能。

同时，我们采用实例分割模型Mask R-CNN (He et al.， 2017)进行线粒体分割，因为线粒体由生理和功能上的个性化实体组成，DeepContact需要分割每个线粒体进行接触分析。为了避免由于目标线粒体和其他细胞器之间的相似性而导致的假阳性预测，在Mask R-CNN中植入了一个最高可能性损失Top likelihood loss(Xiao et al.， 2019)，通过在训练期间对最疑似的目标区域进行采样来提高模型性能。然后添加相似度损失，以改进正负建议的特征识别(图S1 A)。

图S1
将最高似然采样和相似性损失纳入Mask R-CNN框架的有效性。(a)网络采用ResNet101-FPN作为骨干。在训练RPN时，应用最高似然损失对得分最高的负锚点进行采样，在训练以下分支时，应用最高似然损失对得分最高的负锚点进行采样。同时，在Fast R-CNN分支的fc层上添加相似度损失，以区分负建议和正建议。(b)原始图像。©带有ground-truth标签的图像。(d)基线掩码R-CNN预测。(e)添加最高似然采样和相似性损失的Mask R-CNN预测。红色的虚线矩形表示假阳性的减少。

在推理过程中，我们在每幅图像上随机裁剪了五个斑块，对细胞器进行了分割，并确定了每个斑块上目标细胞器的边界。我们通过编程自动记录和计算细胞器信息，包括数量、周长、面积，以及最重要的 MCS 剖面。此外，我们还根据像素单位测量并记录了每个接触点的宽度。
在本研究中，MCS profile 被定义为线粒体外膜上的相应像素。

因此，ER-Mito contact ratio 计算为Mito_boundary contact除以Mito_boundary。Mito_boundary的计算方法是将单个EM图像上的小块之间的所有线粒体边界求和，同样，Mito_boundary contact是将单个EM图像上的小块之间所有接触的线粒体边界求和。在随后的应用中，同样的原理被用于脂滴(LD)-线粒体接触计算。

为了验证 DeepContact 在分割细胞器方面的准确性，作为黄金标准，一位资深专家精心标注了六张 U-2 OS 细胞图像，这些图像取自一个新的电磁样本区块的一个部分中的六个不同细胞，这些细胞从未参与过训练过程。然后，我们从每张图像中随机裁剪出 5 个片段，共 30 个片段，组成测试集。我们定义了匹配率指标，即正确预测的像素总数除以注释像素总数，以量化预测准确率。线粒体、ER 和 LD 的平均匹配率分别为 97.64%、87.71% 和 98.48%，匹配率的 SD 均小于 10%（表 S2）。

DeepContact 分割与人工分割的比较也通过直接可视化得到了证明（图 S2，a 和 b）。DeepContact 对 ER 的整合模式进行了建模，将高尔基体等其他类细胞器网络排除在模型之外（图 S2 c）。为了进一步确保 DeepContact 对真正的 ER 网络进行分割，使用了 HRP-KDEL 二氨基联苯胺（DAB）染色来突出 EM 图像中的 ER 结构。DeepContact 对ER的分割大多与 DAB 增强的 HRP-KDEL ER 网络相吻合（图 S2，e 和 f）。此外，DeepContact 中植入的最高似然性和相似性损失能有效消除线粒体的假阳性（图 S1，b-e）。这些结果证明了 DeepContact 预测的准确性和稳定性。

图S2
DeepContact 细胞器分割与人工染色和 ER 染色的一致性。
(a）U-2 OS 细胞的原始斑块图像。
(b-d）人工标注和 DeepContact 对线粒体（b）、LD（c）和 ER（d）的分割。红色区域，
DeepContact分割与手动标注的交叉点；绿色，仅手动标注；蓝色，仅DeepContact分割；Nu，细胞核。比例尺为 2 μm。箭头表示高尔基体。
(e）用 DAB 染色的 HRP-KDEL 转染 U-2 OS 细胞的原始补片 EM 图像。
(f）用 DeepContact 对 ER 进行分割。刻度线，2 μm。
(g)用 Labelme 或 DeepContact 模型分割的 ER 和线粒体组合边界线与 0 至 100nm 宽区间的 MCS 长度/线粒体周长比的比较。样本量为 6 个。数据以平均值和 95% 置信区间表示。

为了证明 DeepContact 的效率，我们记录了 DeepContact 分析在单个 Titan 1080Ti 图形处理器内核上所消耗的时间，并与 Labelme 的手动标注进行了比较。DeepContact 分析可分为五个阶段：预处理、细胞器 1 号分割、细胞器 2 号分割、可视化和 MCS 量化。不出所料，在分析特定培养细胞或组织时，DeepContact 在分割各种细胞器的步骤中表现出明显的优势（表 S3、S4 和 S5）。一般来说，DeepContact 程序的每个阶段只需几秒钟，而人工标注至少需要几分钟，有时甚至需要几个小时。分割后，接触参数的计算更为复杂。有经验的研究人员通常需要借助 ImageJ 等软件，花费数小时才能处理等量的数据（随机选择 50 个斑块）。重要的是，DeepContact 估算形态的准确性与人工估算相当（图 S2 g）。这些时间对比表明，在确保准确性的同时，DeepContact 的性能在速度方面优于人工标注，因此非常适用于高通量分析。

Optimization of the quantification procedure for MCSs by DeepContact

利用DeepContact优化MCSs的定量程序

先前曾尝试用荧光探针在接触处对MCSs进行定量分析。因此，我们将常用的ER-Mito触点指示器与DeepContact进行了比较。当U-2 OS细胞被雷帕霉素诱导的ER-Mito系索系统(Csordás et al.， 2010)或基于split-GFP的ER-Mito接触指示物(Yang et al.， 2018)转染时，EM很容易检测到线粒体变性(图S3 b)或聚集(图S3 c)，当过表达split-GFP导致频繁的线粒体异常时，这引起了对MCS测量的担忧。相比之下，DeepContact不需要过度表达探针。在野生型U-2 OS细胞中很少观察到线粒体变性或聚集(图S3 a)。这些结果表明，DeepContact对探针过表达引入的伪迹是无风险的。

图S3
人工系留或接触指示剂表达系统中的线粒体缺陷。
(a）野生型 U-2 OS 细胞线粒体形态正常。
(b）使用雷帕霉素诱导的ER-线粒体系留系统重建的稳定细胞系中退化的形态。
(c）使用ER-Mito MCS重建的单细胞克隆中的聚集形态。缩放条，2 μm。

当细胞在HBSS中培养时，使用各种Split-GFP指标，包括短版（10-nm）和长版（10-50-nm），对营养剥夺下的ER-线粒体MCS进行了量化。在这些研究中，使用短版而非长版 Split-GFP 指标时，检测到的总 MCS 数量增加。使用 DeepContact 中的接触宽度设置，我们发现在短 MCS 宽度范围内（≤10 nm；图 S4，a 和 b），HBSS 处理的细胞中 ER-Mito 接触的数量和长度比都显著增加。10-50 nm 范围内的 MCS 数量比没有变化，这与 Split-GFP 分析结果一致（图 S4 a）。

然而，DeepContact 测量的 MCS 长度比在 10-50-nm 宽度范围内显著增加（图 S4 b），这在之前的分析中没有发现。这些结果表明，基于荧光探针的分析可以报告生理变化时 MCS 形成的整体变化，但却无法捕捉到细节。

图S4
通过DeepContact在各种实验系统中分析MCS和细胞器形态。
(a)在0-10 nm或10-50 nm宽度区间内，HBSS饥饿时MCS数量相对于线粒体总数的变化。
(b) MCS长度相对于线粒体周长的变化。
(c ) VMP1缺失时Mito-ER MCS在0- 30nm宽度区间的长度比改变。
(d)删除VMP1时，在0- 100nm宽度区间内的MCS长度比profiling。
(e) VAPa/b或ATL缺失后MCS长度比在0- 30nm宽度区间的变化及其联合耗尽。
(f)采用VAPa/b或ATL缺失及其联合耗尽的0- 100nm宽度间隔的MCS长度比剖面。
(g)贴壁U-2 OS细胞基部、中部和顶端的ER总周长切片。
(h)从贴壁U-2 OS细胞基部、中部和顶端水平切片的平均线粒体周长。
(i)从贴壁U-2 OS细胞的基部、中部和顶部切片中，MCS的长度比为0- 100nm。
(j)完全培养基中ER的总周长(全)，FBS饥饿(-FBS)，葡萄糖和丙酮酸钠饥饿(- glue &。-S.P .)和HBSS饥饿条件结合OA处理细胞前(Pre-OA)或在(OA)饥饿处理期间(10 h)。
(k)线粒体全周、-FBS、- glue和。S.P.以及HBSS条件与OA前或OA治疗相结合。
(l)线粒体全周、-FBS、- glue和。S.P.以及HBSS条件与OA前或OA治疗相结合。每个实验设置的样本量为30，图中的单个点代表15 × 10 -μm细胞图像的平均值。条形表示95%的置信区间。

根据系结条件的不同，MCSs具有不同的宽度范围。使用DeepContact，接触轮廓的变化可以以1像素为单位的宽度间隔进行解剖，对应的长度为10 nm，从0到10像素(0 - 100 nm)。DeepContact能够解决这些细节是基于精确的分割ER和线粒体的膜边界(图2,a和b)。
在饥饿的u - 2OS细胞,我们提到的总周长增加(图2 c), ER区域(图2 d), ER伸长(图2 e),线粒体的数量增加(图2),以及与对照细胞相比，线粒体平均周长减少更为明显(图2h)。此外，MCS长度比在0-60 nm的宽度区间内不断增加，但在更宽的宽度范围内保持不变(图2 k)。因此，DeepContact能够收集全面的接触相关测量，包括细胞器数量、周长、面积和形态几何(图2,c-j)，以及基于像素的宽度计数(图2 k)，具有以前无法实现的精度。

图2
DeepContact对ER-Mito接触的定量分析。
(a)将ER、线粒体和ER- mito MCS分割为线粒体外膜上跨越一系列ER膜宽度间隔的彩色像素。
(b)色条表示面板a中MCS的0-10像素宽度(0-100 nm, 10 nm分辨率)间隔对应的颜色梯度。比例尺，1 μm。
(c )对照组和hbss处理的U-2 OS细胞的总ER周长。
(d)对照组和hbss处理的U-2 OS细胞总ER面积。
(e)对照组和hbss处理的U-2 OS细胞ER伸长情况。延伸因子，周长2/(4π ×面积)。(f)对照组和hbss处理的U-2 OS细胞的线粒体总数。
(g)对照组和hbss处理的U-2 OS细胞的线粒体总周长。
(h)对照组和hbss处理的U-2 OS细胞的平均线粒体周长。
(i)对照组和hbss处理的U-2 OS细胞的线粒体总面积。
(j)对照组和hbss处理的U-2 OS细胞的线粒体伸长情况。延伸因子，周长2/(4π ×面积)。
(k) HBSS处理时MCS长度/线粒体周长在0- 100nm宽度之间的比值。每个实验设置的样本量为30，图中的单个点代表15 × 10 -μm细胞图像的平均值。c-k柱表示95%的置信区间。

接下来，我们测试了DeepContact在具有更多生理相关性的环境中的灵敏度。自噬蛋白EPG-3/VMP1已被证明可以调节内质网与包括线粒体在内的许多细胞器的接触(Zhao et al.， 2017)。在细胞中删除后，ER-Mito接触明显增加。相比之下，接触位点适配器蛋白VAPa/b已被确定为介导各种基于er的接触。在ER-Mito接触的情况下，PTPIP51或Vps13D以vap依赖的方式桥接两个细胞器(guill<s:1> samander et al.， 2021)。作为对照，atlastin (ATL)是一种内质网膜融合原，缺乏它会导致内质网形态异常，但对ER- mitto接触没有已知的影响。因此，我们使用DeepContact分析了vmp1缺失细胞、VAPa/b缺失细胞和atl缺失细胞。正如预期的那样，DeepContact获得的结果与这些分子机器的功能场景和人工分割获得的已发表结果(Zhao et al.， 2017)一致(图S4, c-f)。这些结果证实，DeepContact能够检测生理环境下MCS profile 的变化。

贴壁细胞的EM样品制备用于维持细胞内组织的天然拓扑结构以及细胞器的形态状态。然而，在MCS组织中，从贴壁侧(相当于极化细胞的基侧)到顶侧(相当于根尖侧)的截面z轴水平可能具有不同的性质。为了验证这一假设，我们从蓝宝石盘上贴壁细胞的连续切片中获得了三个部分的图像数据集，每个部分在z轴上的间隔为~ 2.5 μm。ER- mito接触长度比在不同切片之间没有显著差异(图S4 i)。然而，与基部和中部切片相比，顶端切片的ER总周长(图S4 g)和平均线粒体周长(图S4 h)略有不同。这些结果表明，为了进行无偏分析，强烈建议在类似截面水平的样本之间进行比较。

我们采用了一个主动学习框架(Yang et al.， 2017)，通过对最有效的标注样本提出明智的建议来减少标注工作量(图3a)。从一组特定初始数量的标记数据开始，我们迭代地训练我们的模型。在每个阶段，一个新的模型被训练和测试。我们根据mIoU值选择了最差的10%的图像，从中我们确定了在预测中遗漏的细胞器为困难病例。对于下一轮训练中要添加的额外图像，我们确保新未注释的图像包含足够的具有相似特征的“困难”案例，以便改进模型。在获得新的标注数据后，我们使用所有可用的标注图像开始下一轮训练。以药物诱导的线粒体形态改变为例，我们通过靶向标记和训练有效地将异常形态纳入线粒体模型，并通过可视化很容易验证模型的改进(图3b)。结果，我们注意到三种线粒体药物，羰基氰-氯苯腙(CCCP)、寡霉素A1和mdivi-1，在所有宽度间隔范围内都降低了ER-Mito接触比(图3b)。

图3
通过DeepContact的主动学习功能将新的形态纳入线粒体模型。
(a)示范主动学习程序。
(b) 10 μM CCCP、10 μg/ml oligomycin A1和50 μM mdivi-1处理4 h后，通过DeepContact主动学习功能诱导的新形态融合。标尺:2 μm。
(c )对照、CCCP、寡霉素和mdivi-1处理的MCS在0- 100nm宽度区间的长度比。b中的箭头表示未被原始模型分割的线粒体，但通过两轮主动学习过程被改进的模型分割。每个实验设置的样本量为30，图中的单个点代表15 × 10 -μm细胞图像的平均值。c中的条形表示95%的置信区间。

MCS profiling under combined nutrient conditions

接下来，我们将DeepContact应用于生物环境，其中MCS profile 的变化是重要的，并且与生理相关。
细胞器之间的接触积极参与营养稳态(Lahiri et al.， 2015;Prinz et al.， 2019)。除了上面广泛分析的er - mitto接触外，ld与线粒体之间的接触对于调节脂质代谢和能量稳态至关重要(Benador et al.， 2019;Lahiri et al.， 2015)。
为了研究MCS在适应不同营养供应中的协调作用，我们对U-2 OS细胞在三种不同营养条件下进行了DeepContact分析，包括FBS饥饿导致脂质资源枯竭、葡萄糖和丙酮酸钠饥饿以及HBSS饥饿同时限制脂质和糖的摄入。DeepContact同时对ER、线粒体和LD进行分割，并对ER- mito和LD- mito接触进行数据分析(图4、a和b)。
内质网和线粒体的尺寸和形状发生了偶然的改变，并且在饥饿处理之间没有观察到一致性(图S4, j - 1)。
在葡萄糖饥饿或HBSS处理的细胞中很容易检测到LD扩增，但在fbs饥饿的细胞中却没有(图4 c)。LD- mito接触的宽度建议在30 nm以内(Lahiri等，2015);因此，对≤30 nm的接触进行LD-Mito接触分析。与未处理的细胞相比，在这些条件下，短宽度间隔(≤10 nm)的ER-Mito接触和LD-Mito接触普遍增加(图4、f、h、i和k)。当血清饥饿或葡萄糖饥饿时，ER-Mito接触宽度在20至80 nm之间略有减少(图4、1和1)。
我们还引入了在饥饿之前或饥饿期间过量饲喂油酸(OA)来监测接触适应。一致地，在OA处理后ld的生长是明显的(图4、d和e)。令人惊讶的是，即使在OA条件之前和期间进一步诱导LD-Mito接触，与未OA处理的细胞相比，ER-Mito接触普遍减少，特别是在血清或葡萄糖饥饿组(图4,f - 1)。这些结果表明了先前未确定的ER-Mito和LD-Mito接触体之间的代谢协调，并证明了DeepContact能够全面揭示多种类型mcs的系统变化。

图4
MCS在不同营养条件下的协调。
(a) DeepContact对LD、线粒体、ER、LD- mito MCS和ER- mito MCS的分割。比例尺，2 μm。
(b)色条表示图a中ER-Mito MCS的0 ~ 100nm宽度区间对应的颜色梯度。
©完全培养基(Whole)、FBS饥饿(-FBS)、葡萄糖和丙酮酸钠饥饿(-Glu&;- sp)和HBSS饥饿条件。
(d)在Whole， -FBS， - glu和(OA)饥饿处理前(Pre-OA)或(OA)饥饿处理期间，OA处理的总LD周长。S.P.和HBSS条件。c和d的单位是像素。
(e) Whole、-FBS、-Glu&的总LD周长水平。S.P.以及HBSS合并OA前或OA治疗。
(f) <30 nm的LD-Mito MCS在Whole、-FBS、- glu&g中的长度比。S.P.和HBSS条件。
(g)在Whole、-FBS、- glu&o中，Pre-OA或OA处理的<30 nm LD-Mito MCS的长度比。S.P.和HBSS条件。
(h) LD-Mito MCS在Whole、-FBS、- glu&g中的水平。S.P.以及HBSS合并OA前或OA治疗。
(i) ER-Mito MCS在Whole， - fbs， - glu &中0- 100nm宽度区间的长度比。S.P.和HBSS条件。
(j)在Whole、- fbs、- glu&o中进行Pre-OA或OA处理后，MCS在0 ~ 100 nm宽度区间的长度比。S.P.和HBSS条件。
(k和l) <10 nm (k)和20 - 80 nm (l) ER-Mito MCS长度比在Whole、-FBS、- glu&l中的水平。S.P.以及HBSS合并OA前或OA治疗。每个实验设置的样本量为30，图中的单个点代表15 × 10 -μm细胞图像的平均值。c、d、f、g、i和j中的条形图表示95%置信区间。

MCS profiling in epithelial tissues 上皮组织的MCS特征

由于细胞类型的变化和复杂的细胞-细胞纠缠，组织中MCSs的定量分析具有挑战性。同时，由于MCS组织与生理或病理过程密切相关，因此迫切需要它。因此，我们开发了一个用于细胞类型特异性MCS分析的DeepContact组织模型。

支持细胞是授精上皮中唯一的体细胞类型，为精子发生提供结构支持和营养(Hess和Vogl, 2015)。在支持细胞的包围下，生殖细胞以循环的方式从精原上皮的基部迁移到腔内(Hess和Renato de Franca, 2008;Leblond and Clermont, 1952)。支持细胞内的细胞器通信已被认为在整个输精管上皮周期的精子发生过程中发挥作用(Lyon等，2017;Vogl等人，2018)。

我们检查了这些细胞中ER-Mito接触的动力学是否符合周期。支持细胞拥有巨大的基底-顶端极性区域(Hess和Vogl, 2015)。

由于上述原因，我们将重点放在这些细胞的基底部分，通过DeepContact进行无偏ER-Mito接触探测(图S5)。小鼠精原上皮周期被划分为12个阶段，大致分为早期、中期和晚期(Cheng, 2009)。

在早期和中期，总内质网周长和平均线粒体周长相似，在晚期两者均显著增加(图5,a和c)。
相比之下，内质网和线粒体的延伸系数在后期都有明显的下降(图5、b和d)。此外，在≤30 nm宽度区间内，ER- mito接触长度比在后期比在早期和中期更低。当宽度间隔≥40 nm时，各阶段间无显著差异(图5 e)。

接下来，我们分析了ER-Mito接触剖面，使用宽度间隔≤30 nm的精管样品，在超薄切片的大视图中具有足够的分期特征，因此可以准确确定相应的阶段(图S5)。

接触从第I阶段开始逐渐增加，在第VII阶段后期达到最高水平，在第VIII阶段后期略有下降，但在第IX阶段显著下降，并维持在低水平直到第XII阶段(图5 f)。值得注意的是，在第VII阶段晚期的大多数情况下，观察到池内内质网与细长线粒体对齐(图5 g)，而肿胀的圆形内质网结构经常在第IX阶段接触圆形线粒体(图5 h)。

综上所述，DeepContact组织模型的这些结果揭示了Sertoli细胞中的ER-Mito接触变化波，伴随着参与细胞器的形态变化，这可能与细胞中的功能转换密切相关。

图S5
使用DeepContact分析Sertoli细胞中ER-Mito接触的工作流程。
从EM获取大图像，从大视图裁剪分期图像。
这些标注包括支持细胞的质膜、线粒体和内质网。
质膜用于提取RoI, RoI是支持细胞范围内的区域。
我们通过调整大小、随机翻转、仿射变换、高斯模糊、裁剪和归一化等一系列操作对staging图像进行预处理，得到标准尺寸为1024 × 1024像素、分辨率为10 nm的patch。
IoU表示RoI面积与整个图像的比值，对每个样本进行计算。只选择IoU > 0.15的样品进行分析。
我们采用fScore损失、IoU损失、Dice损失和BCE损失来训练ER分割模型，采用相似损失、顶似然损失、CE损失、边界盒回归损失和mask IoU损失来训练线粒体分割模型。
ER分割模型的输出是整个ER区域。线粒体分割模型的输出是单个线粒体的实例。
DeepContact使用ER区域和线粒体实例计算数量、周长、面积、比率和MCS剖面。
MCS配置文件包括由不同颜色表示的1到10像素宽度间隔的长度和比例。左图大、中尺寸视图比例尺，10 μm;在左侧面板的靶基底视图和斑块视图中，2 μm;右面板放大图:0.5 μm。

图5
精系上皮组织支持细胞的MCS波。
(a-e)总ER周长
(a)， ER伸长率条件
(b)，平均线粒体周长
©，线粒体伸长情况
(d)，以及MCS在0- 100纳米宽度区间的长度比
(e)精原上皮周期的早期、中期和晚期。N = 60;每个样本包括来自4个精管上皮小管的15张图像。
(f)小鼠上皮周期代表性阶段ER-Mito MCS长度比。计算相邻阶段之间的显著性。第I-II阶段的数据集排列在图的开始列和最后列，以便相邻阶段之间进行统计比较。N = 30;15张来自两个精管上皮小管的图像包括在每个阶段的采样中。图a、b、d和f中的单个点表示精小管基部(15 × 10 -μm大小)一个支持细胞的平均值。显著性采用未配对t检验，并经Welsh校正。， p < 0.05;， p < 0.01;， p < 0.001;****， P < 0.0001, 95%置信区间。
(g和h)七期晚期(g)和九期(h)，从输精管基部到支持细胞≤30 nm的间隔内ER、线粒体、ER- mito MCS的分割，以及ER- mito MCS的放大图。图中的单个点表示15 × 10 -μm细胞图像的平均值。a-f中的条形表示95%置信区间。

Discussion

为了使用EM图像系统地量化细胞内MCS剖面，我们设计了DeepContact并对其进行了高通量定制。通过对传统工作流程进行以下修改，确保了程序的准确性和效率。首先，可以用还原锇-硫代碳酰肼-锇(ROTO)方法制备EM样品，该方法通过对脂质双层的优先染色来突出细胞器轮廓，从而有利于细胞器边界的识别。其次，主动学习过程允许人类通过交互式视觉检查进行干预，并通过有针对性的标记来改进模型，从而确保以准确有效的方式整合新的细胞器形态。沿着这些思路，在分割模型中应用了结合相似度损失的顶似然采样，以避免误报的潜在风险。最后，MCS测量值以像素为基础的宽度间隔绘制，这提供了接触的全尺寸信息，包括系留条件的特征。这样的调整不仅可以计算MCS的数量，还可以精确计算每个MCS的基于宽度的长度，因为MCS的宽度是其功能的关键结构元素，并且在细胞中受到严格调节(Giacomello和Pellegrini, 2016)。

DeepContact基于EM图像的定量绕过了光学显微镜MCS分析中常用的荧光指示剂的需要。正如本文所揭示的，与之前的报道一致，这些指标(包括Split-GFP)的过表达会诱导相应细胞器的人工系结，从而导致细胞器形态异常(Kakimoto et al.， 2018;Tashiro et al.， 2020)。此外，基于荧光共定位的接触分析受到光学分辨率的限制，并且当使用组织样本而不是培养细胞时，通常很难引入指标。因此，DeepContact在分析培养细胞或组织样本中的各种MCSs方面提供了前所未有的精度。

使用DeepContact，我们能够揭示不同营养条件下细胞MCS谱的细微变化。特别是，我们发现LD-Mito和ER-Mito mcs在短范围(≤10 nm)宽度间隔内的长度比在营养匮乏的条件下大多增加，过量脂肪酸以OA处理的形式导致LD-Mito接触进一步增加，但ER-Mito接触减少。这些发现支持LD-Mito和ER-Mito接触在调节脂质和能量稳态中的串扰。在一个简单的饥饿过程中，尤其是葡萄糖饥饿或hbss诱导的饥饿，细胞内脂质通过摄入增加或通过自噬重新分布而迅速聚集并涌入ld。然后在LD-Mito和ER-Mito联系人的帮助下达到平衡。有趣的是，当这种平衡再次受到脂肪酸突然供应的挑战时，LD-Mito接触似乎在处理反应中占主导地位，而ER-Mito接触可能会为此让路。对这些变化的机制研究保证了对代谢途径的进一步了解。

我们还利用DeepContact在上皮组织模型中探测MCS谱。完全分化的支持细胞适应亚细胞重组，伴随着精细胞上皮周期和精子发生的过程(上野和森，1990)。在20世纪90年代之前，亚细胞细胞器的形态计量学研究被广泛开展，揭示了几种细胞器在数量或面积上的周期性变化与精原上皮周期平行，包括线粒体、内质网、高尔基体以及初级和次级溶酶体(Kerr, 1988;Morales et al.， 1986;上野和森，1990)。通过DeepContact，我们发现ER-Mito接触在小鼠Sertoli细胞中以波状模式变化。该波在第七阶段晚期达到峰值，并在第九阶段迅速触底。巧合的是，在波的关键开关点第VIII期，精子发生过程中的两个主要事件同时发生:成熟精子被释放到精小管管腔，血睾丸屏障被重建，以促进preleptotene初级精母细胞从基室进入免疫特权的管腔室。重要的是，这两个事件都是由支持细胞策划的(Cheng, 2009)。我们有理由推测，ER-Mito接触重排在精子发生中起着关键作用。然而，没有新的生殖细胞与支持细胞的关联发生在精子上皮周期的晚期。在第12期发生两次连续的减数分裂，在第I-II期精子数量最多，这需要与支持细胞大量的新结合。这种变化可能需要支持细胞更积极地整合功能，这是通过增加er - mitto关联水平来实现的。正如预期的那样，DeepContact量化的ER-Mito接触的总体水平似乎与与Sertoli细胞相关的精子数量和精子发生的主要动力学密切相关。这些发现共同证实了DeepContact的力量。

Materials and methods

Cell culture

HPR staining for EM

HPR染色显示EM

EM sample preparation of cultured cells

培养细胞的电镜样品制备

Animals

EM sample preparation of seminiferous tissues

精原组织的电镜样品制备

Ultrathin sectioning

超薄切片

Scanning field emission EM data acquisition

扫描场发射电磁数据采集

Transmission EM data acquisition

EM数据采集
由其他研究人员(Zhao et al.， 2017)提供的EPG-3/VMP1缺失、VAPa/b缺失和ATL缺失的roto制备的Cos7细胞切成70 nm厚的切片，在配备Morada G3 (EMsis)的透射电子显微镜(FEI Tecnai Spirit120 kV)下，在100 kV加速电压下，以6,800倍、4.68 nm分辨率检测。

Data annotation

数据标注
Labelme软件(Torralba et al.， 2010)用于手工标注和分割。对于培养的细胞线粒体，在5纳米分辨率的EM图像上注释了ER和ld。大约60张U-2 OS细胞的EM图像和另外17张TM4细胞(一种Sertoli细胞系)的EM图像被注释以训练线粒体模型。对4张TM4细胞的EM图像和12张U-2 OS细胞的EM图像进行注释，训练ER模型。对正常培养条件下或OA和HBSS诱导的U-2 OS细胞的约20张EM图像进行注释，以训练LD模型。对于Sertoli细胞，我们首先在精系上皮组织图像中标注质膜，然后利用质膜提取RoI，排除各种生殖细胞和周围平滑肌细胞的细胞区域。Labelme在I-II期、III期、VII期后期、IX期和XII期选定的约50张代表性图像中对线粒体和ER进行了详细注释，以初始化DeepContact模型。将标注的数据按3:1的比例随机分割，形成训练验证集。在训练最初标记的数据集之后，我们评估性能并根据需要添加训练集。主动学习框架通过对最有效的注释样本提出明智的建议来减少注释工作量。主动学习框架的细节如图3所示。

Top likelihood sampling 最高似然抽样

具有与目标细胞器相似形态特征的细胞结构可能导致EM图像中细胞器分割的假阳性。
在这里，我们提出了一种在Mask R-CNN (He et al.，2020)模型中包含顶似然损失(Xiao et al.， 2019)的最高似然采样策略，该策略在训练过程中对最可疑的目标区域进行采样。
最高似然损失在区域建议网络(RPN)上选择得分最高的负面锚并对其进行优化。随着训练的进行，得分最高的主播应该更能代表疑似目标区域。另一方面，只要这些得分最高的锚点被最小化，所有锚点都会同时被优化为负值。最高似然抽样的RPN损失表示为

然后添加相似性损失以进一步从正面建议中识别所选的负面建议。图S1 a显示了实现具有相似损失的最高似然抽样的详细框架。图S1, b-e显示了这种实施的有效性。

Training details

对于Mask R-CNN模型，检测作为掩码的阈值得分设置为默认值0.5。骨干网为Resnet101，采用随机梯度下降优化方法。学习率设置为0.001，权重衰减为0.001。我们首先迭代15个epoch来训练网络头，然后再迭代10个epoch来训练所有层。整个训练过程持续≤25次，直到损失达到平衡。U-Net模型的学习率设为0.0005，权值衰减为0.0003。U-Net的训练过程持续了130次，直到达到平衡。

Deep-learning analysis procedure

对于培养的细胞，选择所有样本进行分析(图1)。对于每个样本，然后使用训练良好的DeepContact模型分割每个线粒体实例和ER区域。对于Sertoli细胞，DeepContact提取RoI, RoI是通过对质膜的注释确定的Sertoli细胞范围内的区域。IoU表示RoI面积在整个图像中的比例，计算每个样本。只选取IoU > 0.15的样本进行分析(图S5)。接下来，DeepContact提取每个线粒体的边界，根据线粒体和ER区域边界之间的距离计算ER- mito接触。最后，计算ER-Mito MCS长度比为

式中，mito_boundary为一张EM图像生成的小块间线粒体所有边界的长度，mito_boundarycontact为一张EM图像生成的小块间线粒体与内质网所有接触的长度。

Visualization and quantitative analysis of MCS distributions in different length intervals

不同长度区间MCS分布的可视化与定量分析

为了绘制基于像素的接触边界宽度间隔的MCS分布，我们量化了细胞器边缘每个像素的接触长度。生物学上，这种接触满足一对一映射;也就是说，一个细胞器上的每个位点只能与另一个细胞器上的唯一位点进行通信。然而，一些位点的大小只有1-2 nm，而分析图像的分辨率为10 nm，限制了该原理在分析中的应用。然而，我们选择了一种权衡策略，即如果没有其他站点的距离比这对像素(位点)的距离短1像素(>10 nm)，则一对像素(位点)有接触。

以ER-Mito MCS为例，量化接触长度比的步骤如下:定义一个阈值;如果线粒体边缘上的像素距离小于或等于阈值(即10个像素)，则认为它们与ER上的像素接触;分别提取内质网边缘(Edgeer)和线粒体边缘(Edgemito);找到线粒体上与内质网重叠的像素(这些像素不会被考虑到接触分析中);定义矩阵MinDistance，表示每个ER边缘与线粒体边缘至少有一个像素在距离内的最小距离;在线粒体边缘的阈值范围内搜索像素;如果ER边缘与线粒体边缘的距离比其MinDistance值大1个像素，则忽略该边缘;求内质网边缘与线粒体边缘的最小接触距离，记录在DistanceMap中;用DistanceMap值为0定义与内质网区域重叠的线粒体边缘。
伪算法总结如下：

算法1 计算接触
要求：Mito:线粒体预测；ER:预测ER；阈值:视为接触的最大距离。
确保：nmito, ncon:线粒体数量和线粒体-内质网接触;
lenmito, lencon：线粒体长度和线粒体-内质网接触;
MinDistance：线粒体与内质网边缘之间的内质网边缘距离;
DistanceMap：线粒体边缘到内质网的距离;
Canny: Canny算子，提取每个对象的边缘;
ConnectedComponents：查找每个掩码的连通区域;
(ConnectedComponents: find connected regions of each mask)

ncon ← 0
initialize MinDistance ← threshold + 1
initialize DistanceMap ← threshold + 1
overlap ← Mito&ER
edgemito ← Canny(Mito)
edgeer ← Canny(ER)
nmito ← ConnectedComponents(Mito)

for Every pixel (i,j) of edgeer do
	if not overlap[i][j] then
		for threshold pixels (x,y) of mitochondria around ER do
			if not overlap[x][y] then
				Minimum distance der between Mitochondria and ER
				MinDistance[i][j] ← der
			end if
		end for
	end if
end for

for Every pixel (i,j) of edgemito do
	if not overlap[i][j] then
		flagcontact ← False
		for theshold pixels (x,y) of ER around mitochondria do
			Minimum distance dmito between Mitochondria and ER
			if dmito < MinDistance[x][y] + 1 then
				DistanceMap[i][j] ← dmito
				flagcontact ← True
			end if
		end for
		if flagcontact then
			ncon ← ncon + 1
		end if
	end if
end for

if overlap and edgemito then
	DistanceMap[i][j] ← 0
end if

lenmito ← SUM(edgemito)
lencon ← SUM(DistanceMap[i][j] < threshold + 1)

Computation settings

对于Mask R-CNN基线，我们直接使用了它的公共实现(https://github.com/matterport/Mask_RCNN)。对于U-Net基线，我们使用PyTorch模块(https://github.com/qubvel/segmentation_models.pytorch/tree/V0.1.0)。对于接触分析，我们基于Python实现了算法。计算资源是实验室工作站的常用设置。操作系统是Ubuntu 14.04 LTS 64位。我们在单个GeForce GTX 1080Ti图形处理单元上训练和推断模型。其他硬件信息如下:128G内存，40核Intel Xeon CPU E5-2640 v4 @ 2.40 GHz。

Quantification and statistical analysis

DeepContact产生的定量参数为线粒体数目(Mito_number)、线粒体总周长§ (Mito_length)、线粒体平均周长(Mito_length_mean)、ER- mito_contact_number (ER- mito_contact_number)、ER总周长和总面积、线粒体因子和ER延伸率(p2/[4π ×面积]);Zhao et al.， 2017)，以及ER-Mito_contact_length (ER-Mito_contact_length)。通过韦尔奇校正的双尾非配对t检验计算显著性(非参数，不假设标准差相等)。数据分布假定为正态分布，但未进行正式检验。使用GraphPad Prism 8.3.0生成所有类型的图、热图和统计数据。每个图中的单个值表示一张显微照片中相应参数的总和或平均值，代表细胞主体部分的细胞器信息。除非另有说明，每个实验设置的样本量为30。测量结果来自不同的样本。