【生物信息学】外泌体miRNA成长训练营(14天）

0、大背景

现阶段，miRNA的研究已经进入了白热化时代，不管是什么研究方向，科研者皆是熙熙攘攘，这也致使miRNA研究越来越难冲击高分文章。所以江湖传言，miRNA似已过时。其实，这并非事实，而miRNA作为科研新手之友，从SCI灌水到冲击10分大关，它都有套路可以学。

所以本期《miRNA研究套路课》训练营依旧秉着“文章模块化拆解”的核心思想，剖析经典文献范例，以便总结出miRNA研究的标准配备模板。课程中所讲解的范例文献来源于2017年发表在oncogene杂志的一篇文章，细致讲解了miRNA是如何搭乘外泌体一路青云直上的。

而为了让学员们更好地领略范例文章的研究套路与文章框架，套路课的第一章则分为四个小节，对其进行详细阐释。先是通过从读题猜要素、看图对恒量、分组辨套路、读题识变量、看图解机制、结果推结论、检索探背景、溯源揭创新这八个层次来进行解读范文信息提炼隐藏其背后的科研规律；其次，通过解读文献数据的内在逻辑，来抓取文章关键信息，并以模块化思路领会文章数据的逻辑观点与说理套路，进而提炼出miRNA研究框架，进而演变成通用的课题研究设计框架，以便后续类似研究方向的课题开展；然后也介绍了miRNA的背景知识和基础知识、外泌体分离与鉴定，血管新生实验及转移相关实验，同时辅以外泌体相关数据的使用教程，相信定能帮助学员们掌握从海量数据中挖掘有关外泌体miRNA的一些宝贵信息，从而将其灵活应用至自己的研究中，后续才能产出独属于自己的SCI。

本期训练营共14天，每天晚上18:00发布学习任务，我们每天会安排1-2节课的学习，每课时在30分钟左右，干货多多；本期成长营是作为首发福利免费开放，所以小伙伴们先点击链接领取优惠券-之后跳转到训练营页面0元购买-激活课程。（能够看到课程视频即为激活课程）激活过程中遇到问题可以私聊我解决哦，如果之前参加过本主题成长营的话不需要开通课程哦，直接在学习记录里找课看即可~

第四部分：学习规则
给大家介绍了课程，再给大家说下怎么学习

1、miRNA研究简史

定义和作用机制

核糖核酸（缩写为RNA，即RibonucleicAcid）
脱氧核糖核酸（DNA，为英文Deoxyribonucleic
acid的缩写）,又称去氧核糖核酸

mirna是动物、植物、微生物，甚至包括病毒在内的生物普遍存在的一类单链非编码小RNA分子，他们的序列长度，大约是22到25个nt，并且在物种间具有一定的保守性。它的靶基因是mRNA，通过结合在mRNA的3’端（也就是下游靶基因的3’ UTR区域），可能以降解或者只是阻止翻译的方式抑制蛋白表达（也有促进蛋白表达的，单非常少见）。

产生与发展

1993年，利用定位克隆技术，发现了lin-4基因（也就是miRNA gene，miRNA基因），进一步研究发现，该基因不编码任何蛋白，但是却编码一个长度大约在20个核苷酸的小分子rna，这个小分子rna与线虫意识发育时序通路基因lin-14的mRNA的3’非翻译区特异性结合，进而抑制Lin-14基因的翻译。负调控lin-14蛋白的表达。

2000，发现let-7基因，这个miRNA通过与lin-31基因(DNA)的3’UT之间，形成互补结合，从而负调控lin-31蛋白的表达。同时发现，let-7序列在不同物种之间具有一定的物种保守性。此后，研究人员意识到，非编码（编码蛋白质）小RNA，也就是microRNA（miRNA）可能在物种中广泛存在，因此在2001年，science上同时有3篇文章，报道物种中存在大量非编码RNA,并且将其统称为microRNA（miRNA），从此miRNA的研究便火热起来，是生物学研究的热点领域之一。

（补充：保守性一般是在进化理论中应用较多，“保守性好”指的是发生突变的几率低。
随着遗传学和分子生物学的进步，进化方面的研究已经远远超过物种外在表型的水平了。科学家研究遗传物质，一般是DNA的序列发现，分类学上亲缘关系较近的物种的基因信息之间的差异也较小，而亲缘关系较远的物种间基因信息之间的差异也较大。同时由于DNA经过转录和翻译表达蛋白，故蛋白质中的氨基酸序列与DNA含的遗传信息也存在很多相关性。）

命名规则

1. 规则统一前，最先被发现的miRNA，根据其表型，分别被作者命名为lin-4,let-7等。
2. 在2001年，ruaifuken等三个实验室，同时发现大量的非编码小RNA,因此他们商定将小RNA统一命名为microRNA（简写为miRNA)，并按照发现顺序进行数字命名miR-X，相应的miRNA编码基因，用小写字母及斜体表示mir-x。
   

   • 高度同源的miRNA序列给以相同的名字，并增加一个小写字母，代表同源序列间的少数碱基差异。如(miR-2a、miR-2b）。如果在基因组不同位点产生相同的miRNA,则在其后面，进一步加上短横线，以及数字后缀，比如mirna-6-1，mirna-6-2。

   • miRNA的初级转录前体，被称为primary miRNA。发卡结构被称为直接前体precursor miRNA，对于来自同一个precursor miRNA前体的两个miRNA分子，则用类似miRNA-56以及miRNA-56*表示，其中带星号的miRNA,表示表达量比较低，属于隐性表达。如果不知两个miRNA的显隐性表达关系，则用如miR-142-5p以及miR-142-3p的形式来表示，表示两个miRNA分别来自同一发卡前体的靠近5’或靠近3’的序列。

   • 在表示不同物种来源的序列相同的miRNA分子时，在序列前面加上3-4个字母，代表物种的前缀。例如来自人类的miRNA标注为hsa，小鼠为mmu）

   • 补充：https://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_entry.pl?acc=MI0000242，hsa-mir-199a-1的成熟体就是Mature sequence hsa-miR-199a-5p和3p，具体遇到的时候你都到数据库查一下。老师，最后一点了，这个小写指的是我画箭头的哪一个呢？他们都是双链。还有就是，这个dsRNA和siRNA duplex在这个图中的含义是什么呢？dsRNA在这里的作用是？
     小写的这个照视频课程里面的说法？应该值得是基因，dna上的序列。如果是RNA，你看它长度，如果是60nt左右的，就是已经剪切成pre了，pri是更长的。他这里dsRNA应该是说的，其他途径的双链RNA，也有可能出现miRNA的这种抑制作用，譬如你外源表达一些干扰的siRNA，也可能出现相似的作用。

参考资料：
https://mp.weixin.qq.com/s/UaF0H2j9S3WLPHnRU6QP5Q
https://mp.weixin.qq.com/s/1mXvAH3lVcwgSIE2Oqrh4w

miRNA的生物合成过程

动物的miRNA生成，是一个极其复杂的生物学过程，大部分miRNA gene(miRNA基因），通过RNA聚合聚合酶2，转录成原始转录本，也就是Pri-miRNA(primary-miRNA)，这个原始转录本的典型特点就是，具有一个双链颈环结构，一个末端环和两侧非特定结构的单链部分，这个Pri-miRNA在Drosha酶的作用下，加工形成一个包含有大约70个核苷酸的颈环RNA,也就是前体miRNA(Pre-miRNA)，Pre-miRNA迅速被转运蛋白X-potting5（不确定是不是这么写）转运到细胞质当中，X-potting5不仅可以将细胞核内的Pre-miRNA转运到细胞质当中，而且对于维持细胞核内Pre-miRNA的稳定性也十分重要。在细胞质中，Pre-miRNA在3形RNA酶Dicer的作用下，被剪切成大约含有22个核苷酸的双链miRNA结构，也就是miRNA和miRNA的双链结构，随后这个双链结构被解旋，其中一条链被称为Gaid-strange（不确定）,它能够和AIGENOTE（不确定）蛋白结合形成RISC复合体，也就是RNA indust silencing complex, 也就是RNA诱导沉默复合体，这一条链被称之为miRNA，就是一条成熟的miRNA，另一条链被称为Passing strings很快会被降解，用星号表示，也就是miRNA，至于哪一条链能够被装载到aigenote蛋白上（蛋白名称不确定），主要取决于miRNA，miRNA*双螺旋结构的内在热动力学不稳定性。其中5’末端，相对更不稳定的那条链将被装载到aigenote蛋白上，形成成熟的miRNA，所形成的RISC复合体利用miRNA为模版，通过碱基配对的方式指导aigenote蛋白识别并且剪切靶标mRNA，或者抑制其翻译。

miRNA降解过程

在成熟的miRNA发挥功能的过程中，RISC（RNA-induced silencing complex,RISC ，RNA 诱导沉默复合体发挥了最为核心的功能。介导了成熟miRNA抑制下游靶基因mRNA的翻译或者直接导致下游靶基因mRNA的降解。RNA诱导沉默复合体RISC是由多种不同的生物大分子组装而成，其中最重要的三个组分，分别是1、成熟的miRNA分子，2、Dicer酶和 3、AGO蛋白家族成员。
Dicer酶的作用是在细胞质中，将Pre-miRNA剪切成大约含有22个核苷酸的双链miRNA结构，也就是miRNA和miRNA*的双链结构，Dicer酶是RNA酶3家族成员，在进化上高度保守，序列分析表明，各物种的Dicer都具有相似的结构域，在这其中，Dicer的n端，是一个RNA解旋酶结构域。随后是一个PAZ结构域，在C末端是两个RNA3结构域，和一个双链RNA结合结构域，也就是double strings RNA binding domain dsRBD。位于Dicer c端的RNA3结构域和双链RNA结合结构域，在辅助蛋白的参与下， 共同介导Dicer酶，催化双链RNA切割为成熟的miRNA，随后参与RISC复合物的装配起始过程。aikenoke（不确定拼写）蛋白，是一类在进化上保守的蛋白家族，其家族成员能介导成熟miRNA发挥下游基因沉默的功能，gikenote蛋白家族，可以分为aigenoke蛋白和payway蛋白两大亚家族。目前发现，aigenote基因在不同的生物体内数量不同。比如：在某酵母中有一种，在某线虫中有27种。aigenoke家族成员结合miRNA,指导miRNA分子根据序列识别下游靶基因，并且使miRNA下游靶基因发生沉默。acknote蛋白和相关的miRN构成RISC复合物，而且是RISC复合物当中最关键的组分之一。结构生物学的研究发现，Aignoge（AGO)蛋白家族成员，有两个重要的功能保守结构域，分别是PAZ结构域和PAWAY结构域。aignoke蛋白中的paz结构域，是由六条beita折叠组成的桶装结构，结合miRNA，payway结构域能特异性地对靶基因mRNA进行剪切，paiway结构域有两个保守的金氨酸残基，而且他和RNA酶h，有相似的结构，依赖于镁离子发挥作用。

miRNA与其下游的靶基因mRNA之间，通过复杂的网络调控关系共同参与介导了细胞的重要生理和病理过程。在miRNA调控的过程中，成熟miRNA分子的降解，和成熟miRNA分子的生物合成一样重要，而且共同调控了细胞的功能。在miRNA的成熟过程中，会产生一个双链的结构， 这个双链结构中，有一个gaid strings 未来会成为成熟的miRNA分子，另一个是passenger strings,也就是miRNA*。在细胞质中，gaid strings会和aignoke蛋白相互结合，在和aignoke蛋白结合之后，gaid strings分子稳定性会大大提高，相反passenger strings也就是miRNA*链，则会被降解，有研究发现，aignote蛋白会更加偏向于和有很多下游靶基因的miRNA分子相结合，但是却不会倾向于和没有靶基因的miRNA分子，发生相互作用。这也解释了为什么aignoted蛋白，能够和gaid strange结合，而不和passage strange结合。因为gaid strange下游靶基因很多，而passage strange下游几乎没有靶基因。即便是来源于gaid strange成熟的miRNA分子，在发挥完生物学功能之后，也要通过生物降解途径关闭相应的功能。在线虫当中，成熟miRNA分子的降解过程由5’到3‘方向的核糖核酸外切酶，XRN-2介导完成。核糖核酸外切酶XRN-2有时也会被称为rages-1p，在植物当中，成熟的miRNA分子，降解过程中，是由小RNA降解核酸酶 （small RNA degreding nuecl…) SDN家族成员介导，但是降解的方向和线虫中的方向正好相反，是以3’到5’的方向进行，在动物体的基因组中，也编码了类似的酶，但是这些酶在动物体内发挥降解成熟miRNA的机制并不是特别的清楚。还需要进一步的研究。

2、miRNA细胞学功能与疾病相关研究

在植物细胞内，miRNA通常都可以和靶基因mRNA的序列之间形成序列上的完美匹配。但是在动物细胞内，miRNA和靶基因mRNA之间，通常并不是完美匹配，而是部分匹配，只需要有7-9个碱基的匹配即可。因此，一个miRNA分子可以影响下游很多的mRNA，反之，一个mRNA也可以受到很多miRNA的调控。所以miRNA和mRNA之间的调控网络极为复杂，也正是因为如此，miRNA几乎参与了所有重要的细胞学功能。

1. miRNA调控基因的分化与发育
   通过基因突变，基因敲除和转基因等研究方法发现，很多miRNA分子对控制细胞分化，器官形成，和生物体发育等过程都起到了十分重要的作用。miRNA影响生物发育的最初证据来源于对线虫发育进程的研究，在线虫幼虫的发育过程中，miRNA lin-4发挥重要的时间控制作用，它的两个重要靶基因lnc-14和lin-28所编码的蛋白分别调控线虫从l1期向l2期转化，以及线虫从l2期向l3期的转化，lin-4基因缺失或者基因突变，可以阻滞幼虫特定细胞的分化，另一个miRNA分子，let-7和Lin-4具有类似的功能，同样参与线虫发育的时序调控。在哺乳动物中，miRNA-181a 在调控B淋巴细胞的分化方面发挥重要作用，同时它也参与了T细胞的发育。
2. 其次，miRNA调控了细胞的增殖
   有研究发现，在分化培养基中，miR-1能在体外培养的成肌细胞中过表达，从而抑制了细胞增殖，并促进了细胞的分化。与此类似，在心脏发育过程中，过表达miR-1也能抑制细胞增殖，从而使心室壁变更薄片。
   3.再次，miRNA调控细胞凋亡
   细胞凋亡是由基因控制的，细胞自主的有序性死亡，是有机体用来维持 内环境稳定的重要方式，在线虫和果蝇等模式生物中，科学家们发现，miRNA能够调控很多细胞凋亡的信号通路，比如在果蝇中miR-14突变体，能够提高凋亡因子，细胞凋亡蛋白酶drice的基因表达水平，因为drice基因编码的蛋白质，能够调控细胞凋亡和脂质代谢，所以miR-14能够作为细胞死亡的抑制剂，它的过量表达，会抑制细胞的死亡。另外，也有研究发现，抑制miR-1d,miR-7,miR-148,204,210,216,296等，能够明显提高细胞凋亡蛋白酶Caspse-3的活性，而抑制miR-214的表达，则会显著降低Caspse-3的活性。还有研究发现，miR-29能阻止细胞凋亡的开启，并且在某些神经退行性疾病如老年痴呆症，亨廷顿舞蹈病等病症中进行的短期给药实验中，展示出显著的疗效。
   

在正常的细胞内，miRNA参与了几乎所有重要的细胞生理功能呢，所以它的失调，也是导致很多疾病发生的原因之一，几乎每一种疾病中，都可以观察到miRN的作用。研究发现，在疾病发生发展的过程中，mIRNA既可以促进疾病发生也可以抑制。以肿瘤为例，在几乎所有的肿瘤类型中，都能观察到miRNA参与其中,miRNA分子既可以发挥类似于癌基因的作用，也能发挥类似于抑癌基因的作用。由于miRNA分子，通过结合到下游靶基因的3’ UTR区域，并抑制下游靶基因的蛋白表达，因此miRNA在肿瘤发生和发展过程中，所发挥的具体功能和作用，主要是由miRNA下游靶基因所处的信号通路所决定的，历史上第一个被证实的与miRNA调控紊乱相关的疾病是慢性淋巴细胞白血病，在恶性的鼻细胞中，miRNA参与调控并介导了鼻细胞的很多重要的发育过程和功能，例如鼻细胞受体信号、鼻细胞的迁移和粘附、在免疫过程中的细胞和细胞之间的相互作用，以及免疫球蛋白的产生和类别转换。miRNAf分子除了参与调控和鼻细胞发育相关的功能之外，还影响了鼻细胞成熟过程，参与调控功能边缘区鼻细胞，滤泡鼻细胞、血浆鼻细胞和记忆鼻细胞的产生过程，c-myc是一个非常著名的癌基因，在很多种肿瘤类型当中，都能检测到它的突变，在小鼠体内，过表达c-myc之后，发现c-myc能促进很多miRNA分子的表达，在其中包括了miR-17-19基因簇，c-myc和miRNA分子同时表达升高后，能同时影响白血病的发生和发展过程，在过表达了c-myc的淋巴瘤小鼠动物模型当中，过表达了miRNA之后，这些miRNA分子，包括miR-150、155、21、34a、14-92基因簇，15基因簇、16基因簇可以使小鼠在很短时间内发病，并很快死亡。相反，未过表达的小鼠可以活很久。

之前已经提到，miRNA发挥作用的机制，是结合到下游靶基因的3‘ UTR区域，抑制下游靶基因的蛋白表达，因此miRNA在肿瘤的发生和发展过程中，所发挥的具体功能和作用主要由miRNA下游靶基因所处的信号通路决定。在肿瘤的发生和发展过程中，发挥重要功能的信号通路非常多，在肿瘤中，常见的信号通路就有
我们以DNA损伤修复通路为例，说明miRNA发挥作用的机制。

在正常细胞内，如果出现DNA修复机制的障碍，会导致细胞内DNA损伤和突变的积累，从而导致正常细胞的癌变，因此DNA损伤修复机制功能的紊乱，是导致肿瘤发生最重要的原因之一。miRNA同样可以通过调控DNA损伤修复机制中的关键基因，从而参与介导肿瘤的发生，miRNA调控DNA损伤修复机制的途径有两种，直接调控的方式和间接调控的方式。有很多的研究都发现，miRNA分子可以直接抑制DNA损伤修复基因的表达水平，例如在散发性结肠癌中miRNA-155表达升高，从而直接抑制了DNA损伤修复基因MLH1的表达，导致DNA损伤修复机制的紊乱，另外在胶质母瘤细胞的组织中，也发现miR-181表达升高之后，通过与DNA损伤修复基因MGMT的mRNA 3‘ UTR区域结合，抑制了MGMT的表达水平，导致恶性肿瘤的发生。PPT中的这张图表是把目前发现的能直接参与调控DNA损伤修复途径基因的miRNA分子进行的总结。这就是miRNA直接调控损伤修复基因从而导致肿瘤发生的机制。

miNRA调控DNA损伤修复基因的第二种途径是间接调控，HMGA是一类大概含有100个氨基酸的多肽，它含有多个AT hock结构域，HMGA能结合DNA的小勾，从而影响染色体的结构，并导致下游基因转录的变化，在正常的成体组织内，几乎检测不到HMGA的表达，但是在肿瘤发生时，HMGA的表达水平会急剧升高，已经证实，HNGA1可以结合到DNA损伤修复基因，BRCA1的启动子区域，并抑制DRCA1的表达。HMGA2可以结合到DNA损伤修复基因，ERCC1的启动子区域，同样抑制ERCC1的表达，因此肿瘤发生的一个很重要的机制就是细胞内HMGA1和HMGA2表达升高。随后，在HMGA1和HMGA2表达升高之后，这两个分子通过分别结合到下游BRCA1和ERCC1的启动子区域，抑制这两个DNA损伤修复基因的表达。从而导致细胞内DNA损伤修复功能的紊乱，最终导致细胞癌变。有研究证实多个miRNA分子可以调控HMGA1和HMGA2的表达，这些miRNA分子包括miR-15、miR16、miR-26a、miR-196a、Let-7a。临床组织样本检测也证实，在肿瘤组织内，这些miRNA分子的表达，显著降低，相反，这些miRNA分子的下游靶基因，也就是HMGA1和HMGA2的表达显著升高，所以在肿瘤发生过程中，miRNA分子首先表达降低，随后导致HMGA1和HMGA2表达升高，最终通过抑制DNA损伤修复基因DRCA1和ERCC1的方式促进了肿瘤的发生。

miRNA的应用

miRNA的研究成果已经开始应用于临床，并取得了非常好的效果，。

1. 应用1:早起筛查
   miRNA可以在细胞内合成，并且被转运到细胞外，进入血液循环系统。因此在临床应用当中，通过检测血浆内的miRNA分子并预测疾病的发生和发展，是非常重要的应用方向。有一项研究，通过检测血浆中miRNA的表达谱的变化筛查早期的结直肠癌患者。研究人员通过miRNA表达谱变化分析，发现早期可切除的二期结直肠癌患者的血浆miRNA表达谱和健康人的miRNA表达谱有显著的差异，因此此类miRNA表达谱的变化差异可以从正常人群当中筛选出早期可切除的结直肠癌患者，并达到了比较高的准确性和特异性。

2. 应用二：作为预后的生物标志物marker
   miRNA的表达也同样和肿瘤的预后密切相关，在非小细胞肺癌NSCLC当中，研究发现低表达miR-324a的患者，往往预后较差，在结直肠癌患者体内，高表达miRNA-185且低表达miR-133b和肿瘤的转移以及较差的预后密切相关，miRNA分子中，有一类特殊的miRNA分子，被称为cycle miRNA，也就是循环miRNA分子，这类miRNA分子，由肿瘤细胞所分泌，并且可以在血液中高度稳定的存在，这类循环miRNA分子，在癌症的发生发展过程中，被过度表达和激活，而且这些分子可以通过诊断实验室进行定量检测，在霍奇金淋巴瘤当中，血浆miR-21，494以及1973，有望成为对于疾病反应性评估的生物标志物。循环miRNA还可以帮助临床进行诊断，或者成为肿瘤转移或者预后的marker等等。

3. miRNA用于疾病的分子分型
   某些特定的miRNA分子，和截直肠癌特定的组织亚型密切相关，例如在黏液性结直肠癌和溃疡性结肠炎诱导的结直肠癌患者中，miR-205和miR-373的表达显著增加，但是在缺乏粘液成分的散发性结肠腺癌中miR-205和miR-373的表达却没有显著的变化，体外研究也表明，miRNA-205和miR-373可以在肠道上皮细胞中诱导肠道上皮细胞表现出一定的黏液性恶性增生的特征。因此，这一类具有组织亚型特异性表达的miRNA分子未来有望成为疾病分子分型的依据。miRNA的研究在慢性淋巴细胞白血病的分型的临床应用当中也有了重大的进展，研究人员通过对217个miRNA活性的分析，把这217个miRNA分成不同的signature，根据这些signature，可以将慢性淋巴细胞白血病进一步细分为不同的疾病亚类，而且由于不同亚类的疾病中，他们的miRNA分子表达谱不同，从而可以判断慢性淋巴细胞白血病患者的疾病进展情况。

4. 应用4:miRNA作为潜在的药物靶点
   有研究提示，miR-205和miR-221可以作为抑制乳腺癌进展和转移的分子靶点，在一项研究中，研究人员挑选了miRNA-205和miRNA-221，并且通过人工合成的方式，构建了一个可以起到结构稳定作用的人工RNA分子，通过miR-205、miR-221和人工RNA分子，构建了一个基于RNA的三重螺旋结构，在这个三重螺旋结构当中，miRNA-205和221是发挥下游功能的效应分子，人工合成的RNA分子，起到稳定RNA三重螺旋结构的作用。这个RNA的三重螺旋结构被包裹在右旋糖苷醛聚合物的凝胶中，被植入了3阴性乳腺癌小鼠动物模型当中。最后，观察到的结果是，肿瘤的体积缩小了90%以上，而且小鼠的存活期也大幅度提升，这个研究结果提示，基于miRNA的肿瘤治疗方法，在未来具有光明的前景。

补充内容

见微知著，miRNA 研究套路解析

中午好，今天的午间分享是见微知著，miRNA研究套路解析——酸谈，来源于酸谈公众号:
非编码 RNA(ncRNA)中，miRNA、lncRNA 和 circRNA 三足鼎立，在科研界中可以说 是风头无两。虽说 miRNA 相比于其他两位略显逊色，但却能凭着独特的研究优势实打实的 成为了科研新手入门的绿色快捷通道。那么本策“见微知著”就讲一讲 miRNA 的规范性研究 套路。
miRNA 研究的三大优势
1)简化工作量。以过表达/沉默做表达差异时只需要 qPCR 验证 miRNA 水平即可，而 无需买抗体做 Western;可直接合成 miRNA 短片段，无需用病毒载体，转染效率高;细胞 水平的“一正一反”操作流程也非常简单。
2)有一套固定的分子机制研究模式，通常可先通过现有的多个数据库进行靶基因预测， 在取交集结果后以荧光素酶报告基因实验(Luciferase Assay)对 miRNA 结合靶基因进行验 证。
3)miRNA 在物种间保守性好，可在人源性细胞和小鼠动物实验使用同一个序列，还可 通过 miRNA 在模式生物中的功能来反推在人类中的功能。
miRNA 研究的基础常识
细胞核内，基因编码转录的初级转录产物 pri-miRNA，会被核内核酸内切酶 Drosha 剪 切为 miRNA 前体(pre-miRNA，70-90nt);当 pre-miRNA 转运到胞浆后，可被 Dicer 酶酶 切产生 miRNA 成熟体(单链 RNA，19-25nt)。
一般一个前体分子是可以加工成多条成熟 miRNA，而成熟 miRNA 可与一个或多个 mRNA 分子的 3’-UTR 不完全互补配对，并依赖 RISC(RNA induced silencing complex)沉 默复合体来下调靶基因表达。
通常要想查询 miRNA 序列，可在其权威数据库 miRBase 中输入 miRNA 名称后，即可 获得其序列的详细信息(解螺旋【单元课】课程中有介绍具体的查询方法)。而 miRNA 的命 名现已经规范化，雨果基因命名委员会(HGNC)为其树立了一个统一标准(见下图)。

除了最早期发现的 lin-4、let-7 等，miRNA 的名字一般都是 miR-XXX(以按照发现的顺 序用数字编码)。其前通常缀有物种名称的拉丁文缩写，如人是 Hsa，小鼠是 Mmu，大鼠是 Rno 等。
当 miRNA 跟已有名称的 miRNA 具有高度同源性，可通过小写的 a/b/c 进行区分。当 miRNA 来源于不同的 DNA 编码区域，则需在 a/b/c 后面加个横杠再以数字 1/2/3 来表示。
基于 miRNA 前体是个茎环结构，加工过程会从 3’或 5’端茎环臂产生最终成熟的 miRNA， 而一般也只有其中一条是表达量高的。以前会把表达量低的加个*号，现在改为用“-s”和“-as” 来命名，并把来源于 5’端的标上 5p，3’端标 3p。
miRNA 研究的表型验证
紧跟 36 策课程的学员应该都知道，单变量论证的标准配置无外乎 12 字诀:表达差异、 正反回复、细胞动物。显然，将 miRNA 带入其中也是毫无问题的，那么在确定有表型的 miRNA 后，仍需要先通过针对 miRNA 的实时定量 PCR(Real-time PCR)检测试剂盒来分析 miRNA 的表达差异情况。
随后在进行 miRNA 正反实验(Gain / Loss of function)验证时，过表达和沉默都只需 要订购短片段合成 RNA，价格低廉且到货周期快。值得注意的是，miRNA 的过表达被称之 为 mimics(模拟物)，而其沉默则被称为 inhibitor(抑制物)。
转染 miRNA 时，一般其过表达或沉默载体均会采用前体 pre-miRNA 的茎环结构，只是 其核心序列发生了变化;也可通过合成的成熟体 miRNA 做瞬时转染。转染后用定量 PCR 来 检测 miRNA 的过表达/沉默效率。最后进行 miRNA 的细胞以及动物水平的验证，即可完成 表型验证。

值得注意的是，在 miRNA 研究套路中做完表型有一件比 Rescue 本身更重要的事情，那 就是找 miRNA 的靶基因。而这便进入了分子机制(Mechanism)研究的范畴，分子机制是 基础科研的核心，领略了这其中的套路变化，才能真正完成新手的逆袭。
miRNA 研究的机制研究
通常解释一个分子/通路介导某种表型/药效背后的原因就是分子机制。其中，用以解释 机制的分子或通路，一般是已知跟表型有关联的，否则还需验证该分子/通路跟表型间的关 系。
机制研究可分为以下两个层次:
间接作用机制是分子机制的初级层次，仅解答了 Why 的问题，即虽然揭示了主变量与 下游因变量存在调控关系，但不清楚它们之间的具体调节作用。
而直接作用机制则是分子机制的高级层次，在 Why 的问题基础上，也解释了 How 的问 题，即也诠释了直接作用的靶点和方式。
其中，miRNA 靶向作用于下游编码基因，就是 miRNA 研究中最简单的一种机制模型。 通常可通过查询在线的数据库，如最权威的 Targetscan，来预测 miRNA 的靶基因。
由于一个 miRNA 有多个靶基因，同一个基因也会受到多个 miRNA 的调节，因而候选基 因会很多，此时可将多个数据库的预测结果取交集，以此来缩小候选分子范围，而后选择其 中一对分子进行研究即可。
随后便需通过文献资料、查询数据库或实验验证(qPCR)来找寻 miRNA 和靶基因 mRNA 的表达负相关证据，再结合荧光素酶报告基因实验(Luciferase assay)，就可获得 miRNA 与靶基因的 3’UTR 是有结合作用的直接作用证据。
而 miRNA 结合靶基因 mRNA 后影响基因表达的方式主要有两种。早期认为 miRNA 与 mRNA 的 3’UTR 结合后会阻碍翻译过程，但不影响 mRNA 的稳定性，即不影响 mRNA 的表 达水平。而后续研究发现，当 miRNA 与 mRNA 完全互补或者近乎完全互补的时候是可以引 导降解 mRNA 的。该现象在动植物中普遍存在。
阻遏翻译和引导 mRNA 降解是两种机制，它们是相互独立的，而非是因果关系。所以 一个 miRNA 过表达，其靶基因 mRNA 可能表达降低，也可能变化不显著，但其蛋白表达水 平则会明显的降低。
但大家也需了解，miRNA 并不是只有抑制靶基因一种作用形式，也有文献报道 miRNA 可以结合在 mRNA 的 5’端 UTR，并能在蛋白的作用下起到稳定 mRNA 的作用，增强翻译而 上调靶基因表达的。
综上，就是 miRNA 作为变量分子类型的研究套路。

肿瘤转移数据的数据库工具——HCMDB

今天和大家分享的是【挑圈联靠】公众号整理的肿瘤转移数据的数据库工具——HCMDB，网址：http://hcmdb.i-sanger.com/index。该工具由华东师范大学的董东教授于2017年发表于著名的《Nucleic Acids Research》，影响因子11.147分。
这个神器收集了GEO和TCGA上29种肿瘤，45种肿瘤亚型，38个转移部位，共124个数据集和7081篇文献的信息。其中表达数据涵盖了mRNA、miRNA、lncRNA， 真香！

下面我给大家简单介绍一下网站的使用，网站的主页如下：可以直接在“Quick Search”直接搜索你想要找的基因。
或者在绿色的“Search”栏里放入你要搜索的内容，可以混合搜索不同类型的RNA。也有多种格式的基因名供你选择，包括ENSEMBL，RefSeq，NCBI Entrez gene ID，uniprot ID。然后点击“Submit”
然后在搜索结果界面会展示上面搜索内容的结果，整个页面每次只会展示一个RNA，点击哪个字体加粗，然后在后面展示出来。我们以“CDKN2A”为例
网页会展示基因的概览

先前研究对这个基因参与肿瘤转移的描述（这个真是好，简单直接的文献证据）

接下来展示了这个基因在不同研究中的表达。点击“Cancer Name”的栏目可以选择你要研究的肿瘤，点击“Filter”后开始筛选。图中的“DIFF”表示有差异表达，“NOT”当然就是不显著了，点击那个图标，可以跳出差异表达的box图，还有共表达的结果。


点击“Exp ID”栏下的蓝色字体可以跳转到对单项研究的结果展示部分：先是会展示一个概览
然后会展示该研究的差异表达内容，包括pvalue，FDR，log(FC)和热图。
点击DEG_function，会展示该研究里的差异表达基因富集到的通路，把鼠标放在圈圈上，可以展示通路的详细信息，包括通路的分类、名称、富集分数、pvalue等。
然后可以在Network部分可以展示差异表达基因的网络图，包括mRNA-mRNA和mRNA-lncRNA两种，点击右上角的图标可以展示不同的展示风格。也可以保存图片。

除了根据基因进行筛选，还可以在Browse开启你的探索之路，选择研究的肿瘤、过滤样本数、选择RNA类型，这些都一气呵成。当然，研究肿瘤的时候常常也会重点关注一些特殊的转移部位， 比如肠癌的肝转移。
工具的介绍就到这里了，这个工具的数据量真的非常可以了，使用起来对用户也比较友好，笔者花了10分钟就基本搞清楚用法了。

拆解 miRNA 与囊泡的组合套路

今天和我们来讲解一下 28 策绝渡逢舟，10 步拆解 miRNA 与囊泡的组合套路，内容来 自酸谈公众号:
上策“半壁江山”介绍了细胞嵌套做半套的研究格式，那么本策“绝渡逢舟”将继续带领大 家领略细胞交互类型课题中的经典模式套路——miRNA+囊泡(外泌体)的组合。
该组合中，主变量 miRNA 分子是由供体细胞输出的，包含了 miRNA 的转录、加工成熟; 而 miRNA 经典的作用机制——结合下游的靶基因 mRNA，抑制其翻译表达则发生在受体细 胞的。
因而只有先弄清楚供体细胞里 miRNA 的表达情况、miRNA 分泌的情况以及包裹在囊泡 中的 miRNA 是否被受体细胞吸收的必要证据，而后才可聚焦于受体细胞 miRNA 结合靶基因 的表型现象来进行研究。
实操步骤
miRNA+囊泡这种细胞交互经典模式的实操步骤，可具体细分为以下 10 步: 1)先用供体细胞的培养上清处理受体细胞，观察受体细胞表型的变化，以确定细胞交
互作用具体存在。 2)检测细胞上清/组织来源血清的微泡或者外泌体里面分子的表达，以获取主变量表达
差异的证据。
3)在确定了一个外泌体中差异表达的 miRNA 分子后，可通过以下两种策略来验证它是
否具有介导细胞交互的功能。
策略一:在供体细胞内过表达或者沉默 miRNA，再用细胞上清刺激受体细胞，与对照
组没有操作分子的培养上清进行比较，看表型是不是被改变了。 策略二:通过商业抑制剂阻断囊泡的合成过程，再用细胞上清孵育受体细胞，与没有阻
断外泌体的组别相比，观察细胞交互表型 Loss of function 的功能。 4)如果囊泡为外泌体，还需对其进行分离和鉴定。外泌体的分离方法包括离心、色谱、
过滤，或者是基于高分子聚合物的沉淀和免疫亲和分离，商业上也有专门的分离试剂盒。 鉴定时可通过透射电镜(TEM)观察外泌体的形态照片，动态光散射(DLS)或者其他 的方法分析颗粒粒径大小、颗粒密度、检测颗粒电荷(Zeta 电位)，以及用 western 或免疫
荧光检测外泌体表面 marker(HSP70、TSG101、CD63)等。 5)观察受体细胞对囊泡的摄入情况。因囊泡具有脂质膜结构，可用亲脂性的荧光染料
(DiI/DiD/DiO/DiR 等)标记外泌体，再观察受体细胞摄入情况。如果是循环分子，没有囊 泡包裹，也可以直接标记分子来观察摄入情况。
6)观察受体细胞中，随着供体细胞基因操作产生的主变量表达变化以及表型变化。
即在供体细胞中过表达或者沉默主变量，用操作基因之后的细胞上清干预受体细胞，观 察细胞上清中囊泡的特性，证明囊泡确实被受体细胞吸收了，以及鉴定外源导入受体细胞内 的主变量分子是否表达变化，表型是不是随之变化。
当 miRNA 为主变量时，在检测 miRNA 成熟体在受体细胞表达变化的同时，还可检测 miRNA 前体在受体细胞中的表达是否有变化。如此可从侧面再次验证受体细胞内 miRNA 主 变量变化来源于供体细胞的培养上清。
7)通过动物实验进行表型验证。细胞交互研究中，既可在动物水平直接改变分子表达 产生表型，也可以在供体细胞上操作分子，再用供体细胞的分泌产物干预动物模型产生表型。
虽然在逻辑关系上，这一步并不必需，但细胞动物是数据严谨性的要求，只有组织、细 胞、动物的证据趋势一致，才能够比较放心地得出靠谱的结论。
8)分子机制方面的挖掘。依据先下后上的原则，可优先考虑受体细胞 miRNA 靶基因的 直接作用机制，具体详情请参考第 11 策的内容。 此外，也可在受体细胞做一套间接机制，如分子+通路的二元关系，先操作主变量观察 通路明星分子表达变化，其次操作主变量，同时逆转通路，看表型回复。
值得注意的是，在细胞交互的课题设计中，操作主变量永远在供体细胞，操作的下游因 变量则永远在受体细胞。
9)下游做完做上游，在供体细胞挖掘主变量如何表达改变的机制。
此时，除了考虑主变量本身表达变化可以有基因 DNA、转录、转录后、翻译、翻译后 五个水平(非编码 RNA 就没有翻译和翻译后个水平)之外，细胞交互的上游还可以从循环 分子如何分泌的角度来挖掘机制。
其中，外泌体介导的信号传递过程有特异性和非特异性两种作用方式，非特异性是指受 体细胞什么外泌体都吞，而特异性是指外泌体表面有膜蛋白，可结合受体细胞膜表面的受体。 10)捋清 Rescue 实验的正确思路。如果分泌分子经由囊泡，则阻断囊泡的合成、分泌、
靶细胞识别等生物学过程可成为 rescue 设计的一种选择，目的是说明细胞交互依赖于囊泡 介导的信号传递。
总之，针对多元变量，围绕主变量的 Rescue 设计是最关键的，因变量与因变量的 rescue 环节可以省略。基于此，除了证明主变量介导表型依赖于因变量，还需要证明主变量介导表 型依赖于细胞交互。如果机制上有多元变量组合，那就再补充证明包含主变量的变量间调控 关系依赖于细胞交互即可。
以上就是《三十六策》第 28 策“绝渡逢舟”的精华内容，

肿瘤转移lncRNA相关数据库——LncR2metasta

今天和大家介绍的是武汉科技大学邓文生教授课题组于20年8月在生物信息学领域国际著名期刊《Briefings in Bioinformatics》发表了另一款与肿瘤相关的lncRNA数据库：LncR2metasta，数据库网址为http://lncr2metasta.wchoda.com。该数据库共收集了在54个肿瘤类型中，304个lncRNA与39个肿瘤转移事件的1283个关联。

下面本工来给大家介绍安利一下这个数据库。

进入主页后，大家可以看到一个朴素的页面，上面红色的方框里表示网站的主要功能模块，下面的红色方框可提醒大家如果数据库帮到了你的研究，请记得引用他们哦。

在Browse模块，大家可以在左边的栏目里看到两个父集——LncRNA和Cancer metastatic event，就是说大家可以直接在LncRNA的选项里寻找感兴趣的目标lncRNA，也可以在Cancer metastatic event根据肿瘤转移的相关事件来寻找lncRNA。如下图所展示，就有一些跟肿瘤从乳腺转移到脑和骨（Breast-Bone，Breast-Brain）相关的lncRNA。

当我们以“LncRNA”模式浏览时，数据库会在右边给我们展示这样的界面来显示结果。上为lncRNA的基本信息，包括名称、分类、在不同数据库里的ID、染色体位置，点击蓝色的字体会跳转到相对应的数据库里。

下面的部分，则会展示lncRNA与转移相关的不同功能，如“Cancer cell invasion”、“Cancer cell migration”、“Cancer cell proliferation”，还有所研究的肿瘤类型、lncRNA的角色、以及参考文献的ID。

如果大家点击蓝色的“Cancer cell invasion”、“Cancer cell migration”、“Cancer cell proliferation”字体，则会跳转出如下界面，展示包括lncRNA的实验方法、表达模式、实验方法、靶向的基因或通路，还有该功能在文献中的描述。

当我们以“Cancer metastatic event”模式浏览时，则可以在每一个对应的事件里查找相关的数据和结果，例如下图中的“Breast-Lung”，就表示“肿瘤原发于乳腺，转移到肺部”这样一个事件，参与这一事件的lncRNA有ANCR和BCAR4。

在Search模块，数据库提供了三个参数进行选择和输入来帮助大家搜索结果，包括“Cancer metastatic event”、“LncRNA symbol, ID or location”类型和具体的名称。

点击“Search”后展示的结果内容也前面的也比较一致，在此就不赘述了。

当然，如果你想要自己下载数据进行筛选的话，数据库也是支持的！


在Download界面，有两个选项可以选择，用户可以框定范围，也可以选择All。

人血液外泌体中RNA的数据库——exoRBase

人血液外泌体中RNA的数据库——exoRBase 资源来源于生信修炼手册公众号
exoRBase是一个人类血液外泌体中RNA的数据库，网址如下：http://www.exorbase.org/
从GEO数据库中收集血液外泌体的转录组测序数据，共收集了来自6个实验共87个样本的数据，每组实验的样本类型都不同，

1. normal persons(NP)
2. coronary heart disease(CHD)
3. colorectal cancer(CRC)
4. hepatocellular carcinoma(HCC)
5. pancreatic adenocarcinoma(PAAD)
6. breast cancer(BC)

另外，又补充了5个人类全血样本，不同类型样本的数量汇总如下

miRNA才是科研套路之济世良方

初学者注意!miRNA 才是科研套路之济世良方，资源来源于酸谈公众号:
今天，我(酸菜老师)就来谈一谈选择 miRNA 作为研究分子类型的战术理由: 1
单个变量代入五恒量，构成了最简单的疾病、表型加上分子的三要素课题。变量的分子 类型很多，蛋白是经典，非编码 RNA 是当红趋势。非编码 RNA 中 lncRNA、circRNA 更有吸 睛效应，为何 miRNA 还有独特优势?

1. miRNA 是非编码 RNA，在做“表达差异”的环节不需要进行蛋白水平的检测，不用买 抗体做 Western，仅 qPCR 检测 RNA 水平即可，简化了工作量。
2. 在执行“一正一反”的 Gain / Loss of function 过程中，miRNA 的过表达和沉默都只需 要订购短片段合成 RNA，价格低廉且到货周期快。同时对于大部分细胞而言，用脂质体转 染法可实现高效导入 miRNA mimics 或 inhibitor 到靶细胞，实验操作简单，易于重复。
   由此可见，在低分灌水阶段(单变量研究，不做机制)，miRNA 的成文效率比做蛋白和 lncRNA / circRNA 高。
   2
   进入到二元变量组合，其中最基本的套路是用通路解释机制，分子+通路的间接调控机 制是最基本的四要素课题(疾病、表型、分子、机制)。
   间接调控关系的口诀是“你动我也动”，即过表达或者沉默主变量，看下游因变量的随之 变化。当你进行下游探索的时候，任何分子类型都执行一样的流程，但是因为 miRNA 过表 达和沉默方便，miRNA 的研究依然有一定便利之处。
   3
   二元变量更好的模式是建立直接调控关系，也就是“知其然知其所以然”——有明确的作 用靶点和调控细节。在所有的直接调控模式中，miRNA 作用于靶基因的 3’-UTR 引起下游靶 基因表达沉默是所有直接作用机制中最简单的套路，没有之一。在实验的操作性、论证的简 约度上，设计 miRNA 二元直接机制优势非常显著:
3. 绝大部分直接机制的研究，都需要至少 2 个关键的实验相互佐证，比如转录因子研 究有 ChIP，EMSA 和 Luciferase Assay，蛋白-蛋白相互作用有 co-IP 和 Pulldown 实验等。 而 miRNA 结合靶基因的验证只有一个经典实验——荧光素酶报告基因实验(Luciferase Assay)，这个实验本身就是直接作用机制研究里最容易开展的实验，也没有之一，就是最容 易做的。
4. 在明确主变量、寻找相互作用的靶基因过程中，都需要走数据库预测或者实验筛选 的流程，RNA 和蛋白相互作用或者蛋白与蛋白相互作用预测的准确度不能说特别高，所以 很多研究者会直接进行实验筛选，放弃预测环节。
   而 miRNA 的靶基因预测可以说是其中准确率最高的作用形式，只需要在几个数据库中 输入 miRNA 名称，即可输出预测靶基因结果，将多个数据库的预测结果取交集，再结合细 胞株中过表达 miRNA 之后，这些靶基因是否具有下调趋势的结果，即可锁定一组直接作用 分子，Luciferase Assay 验证成功，即大功告成。
5. 在机制的 Rescue 验证环节，miRNA 模式单一。经典作用是负调节下游靶基因，所 以口诀是“反正正，反反反”，即上下游同时过表达或者沉默。
   考虑到 miRNA 无论过表达还是沉默都是合成短片段，所以可以根据下游基因的操作便 利度选择上游的策略。如果下游基因已经有过表达克隆，可以用反正正手段，如果下游基因 没有现成的表达工具，就去合成 siRNA 进行沉默，用反反反同样可以快速拿到结果。
   4
   超越了二元变量直接调控，还有更深入的机制模式，比如三元变量结构——miRNA 上 游再提出调控分子，解答驱动因素的问题。miRNA 的转录同样需要转录因子，通过常见的 转录因子机制模式我们可以建立更加复杂的信号轴关系。miRNA 的启动子也能被甲基化调 控，转录出来后也受到剪切过程的调节，能够讲的故事不比其他分子类型逊色多少。
   5
   除了三元变量套路把机制推向更复杂的逻辑链条，还有一条路也适合 miRNA 往高分杂 志走，那就是外泌体介导的细胞间通讯。外泌体+miRNA 的组合是给 miRNA 带来全新活力 的研究套路，进入到多细胞交互的科研境界，已经站在了五分以上的起点上，征服国自然基 金已不在话下。这种高阶套路，我们在套路课的第 3 期就进行深入讲解，上半学年可学到， 打好基础，不要落下学习进度。
   我是酸菜，我为 miRNA 代言!miRNA 研究有 2 个难点，一个是 Luciferase Assay，靠你 们自己突破，另一个是如何预测 miRNA 靶基因或者已知基因反向推测调控的 miRNA，需 要用到一些数据库，这些数据库虽然操作简单，但总有学员感觉难以突破。

什么是mirna?

什么是miRNA呢?

miRNA是一种小RNA分子，长22-25nt，比较保守。在1993年的时候呢，第一个miRNA—lin4就被发现了，再到2000年，第二个非编码RNA—let-7被发现，再到2001年，发现物种中存在大量miRNA，后面就一发不可收拾了。

miRNA又是如何合成的呢？
首先是Pri-miRNA在细胞核里面被Drosha酶剪切变成pre-miRNA，然后pre-miRNA在细胞浆中被Dicer剪切变成成熟miRNA，最后成熟miRNA形成RISC复合物发挥作用。

而RISC复合物（RNA诱导沉默复合体）呢是由成熟miRNA、Dicer酶、AGO蛋白家族形成的。
在这里，Dicer酶功能主要是在细胞质中将pre-miRNA剪切成双链miRNA，而AGO蛋白在进化上保守，结合miRNA从而介导miRNA结合下游靶基因并使其沉默。他在具有保守性，功能保守结构域就有PAZ结构域（结合miRNA）+PIWI结构域（剪切靶基因）。

在今天中午的分享内容中也有介绍哦，大家结合晚间的分享一起看看巩固一下哇。

siRNA、shRNA和miRNA，还在傻傻分不清？

群文件:7.19日

Microrna的命名细则

在确定命名规则之前发现的 miRNA，则保留原来的名字如 hsa-let- 7
命名规则
① 动物：
通式：A-mir/miR-Bc-D-3p/5p
式中字母含义
A：物种名缩写
mir：前体
miR：成熟体
B：发现顺序，采用阿拉伯数字
C：表明高度同源，采用小写英文字母用来区分
D：不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA，采用阿拉伯数字区分
3p/5p：通常一个miRNA前体长度大约为70~80nt，很可能两个臂分别产生miRNA，区分来自不同的臂
② 植物：
通式：A-MIR/miRBc-D-3p/5p
A：物种名缩写
MIR：前体
miR：成熟体
B：发现顺序，采用阿拉伯数字
C：表明高度同源，采用小写英文字母用来区分
D：不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA，采用阿拉伯数字区分
3p/5p：通常一个miRNA前体长度大约为70~80nt，很可能两个臂分别产生miRNA，区分来自不同的臂
③ 病毒：
通式：A-mir/miR-Bc-D-3p/5p
式中字母含义
A：物种名缩写
mir：前体
miR：成熟体
B：发现顺序，以大写英文字母加阿拉伯数字表示如B1
C：表明高度同源，采用小写英文字母用来区分
D：不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA，采用阿拉伯数字区分
3p/5p：通常一个miRNA前体长度大约为70~80nt，很可能两个臂分别产生miRNA，区分来自不同的臂

物种名缩写表

miRNA细胞学功能与疾病相关研究

今天要和大家总结一下miRNA细胞学功能与疾病相关研究大概是什么样的呢？

一般而言，在动物细胞中，miRNA与靶基因是不完全匹配的（7-9nt），所以呢一个miRNA可与多个mRNA结合，同样的一个mRNA可以受到多个miRNA调控。

那么，就目前而言，我们对miRNA的功能有了哪些研究和了解呢？后续如果我想做miRNA相关的研究可以拿哪些作为已知，去做哪些探索性工作呢？

就现有的报道来说哈，miRNA的主要功能有下面这几个方面。

1. miRNA可以调控细胞分化与发育，比如说lin-4可以调控线虫发育，miR-181a可以调控B淋巴细胞分化和T细胞发育；
2. miRNA还可以调控细胞增殖，比如说miR-1抑制成肌细胞增殖和心脏发育；
3. miRNA可以调控细胞凋亡，比如miR-14通过提高drice表达抑制细胞凋亡，抑制miR-1d、miR-7、miR-148、miR-204、miR-210、miR-216、miR-296上调caspse-3活性调控细胞凋亡，但是呢，抑制miR-214可以抑制caspse-3活性，不过哦，miR-29可以阻止细胞凋亡。

如果把miRNA与肿瘤联系起来的话，miRNA可以做癌基因，也可以做抑癌基因。举个例子，cmy可以调控miRN-17-92调控淋巴瘤，此外miRN-17-92插入病毒基因组序列中可以导致白血病，而miR-17、miR-20a通过抑制E2F1可以导致白血病。
而miRNA在肿瘤中发挥癌基因还是抑癌基因的功能主要是有下游信号通路决定的哈。比如PI3K/AKT信号通路、NOTCH信号通路、Wnt信号通路、DNA损伤通路等等。

如果想要与DNA损伤修复联系起来OK么？答案也是肯定的哇。在正常细胞中，如果修复损伤的机制缺失也可以导致DNA损失、突变然后发生癌变。而miRNA调控DNA损伤机制，这包括了直接机制和间接机制，直接机制呢就有miR-15表达上调抑制MH1表达导致结肠癌、miR-181表达上调结合MGMT抑制其表达导致胶质母细胞瘤；而间接机制呢，就是miRNA表达下调，调控HMGA1表达上调抑制BRCA1或者调控HMGA2表达上调抑制ERCC1。

目前结合miRNA与临床研究，相关的内容也包括了好几个方面啦。比如早期筛查，细胞合成进入血液；或者miRNA作为预后标志物，比如miRNA的表达变化与疾病预后之间的关联，又或者是与疾病分型相关，比如说某个miRNA在特定的组织亚型中表达等等。

miRNA研究数据库——TIM2.0(http://www.lirmed.com/tam2/)

7.20日

有用的拼图软件

7.21

Vesiclepedia 数据库：外泌体蛋白质、RNA和脂质体数据库

Vesiclepedia数据库是一个细胞外囊泡分子数据（脂质、RNA和蛋白质）的手工检索数据库。

目前Vesiclepedia数据库收录了41个物种的1254项EVs研究的将近35万个蛋白数据，27646个mRNA，10520个miRNA、639个脂质数据。
Vesiclepedia数据库主要包括Apoptotic blebs 凋亡小泡、Exosomes 外泌体、Microparticles 微粒体、 Microvesicles 微囊泡等细胞外囊泡数据。

Vesiclepedia数据库可以根据物种、囊泡、分子和样品类型等不同的搜索条件来检索和下载数据，不仅提供了与EVs鉴定分子研究相关的实验描述和分子数据，而且支持鉴定Western blotting以及基于质谱仪的肽细节和串联质谱数据。另外，Vesiclepedia数据库还提供FunRich插件，以供用户进行进一步的数据分析。

FunRich基因和蛋白质的功能富集和相互作用网络分析

FunRich是一个独立的软件工具，主要用于基因和蛋白质的功能富集和相互作用网络分析。分析结果可以以韦恩图，条形图，柱形图，饼图等图形表示。

miRNA数据库TargetScan

miRNA数据库——DIANA

DIANA Tools的目的是在系统框架中解释和归档数据，范围包括从深度测序数据的表达调控分析，miRNA调控元件和靶标的注释到ncRNA的作用解释。各种疾病和途径。从目标预测算法（microT v4和microT-CDS），经过实验验证的编码和非编码RNA上的miRNA靶标数据库（TarBase v7.0和LncBase）到能够识别潜在改变的分子途径的软件单个或多个miRNA（mirPath）的表达。此外，新开发的Web服务器（v5.0）支持一系列复杂的工作流程，使用户无需必要的生物信息学基础设施即可执行高级的多步功能miRNA分析。
该数据库能够分析miRNA与靶基因，miRNA与信号通路，miRNA与lncRNA的相关分析，以及自动分析数据。并且可以直接根据序列（新miRNA）预测靶基因，我们还能够查询miRNA发表的相关文章。最后miRNA相关的启动子、调控因子、转录因子当然也是不能少的了。我们想要的miRNA分析功能基本都有了！并且每个工具使用起来超级简单~下面我们依次来介绍这些模块如何使用。

1.miRNA与靶基因调控关系预测
microCLIP、TarBase、microT-CDS三者都是用于分析miRNA与靶基因调控关系的模块。

其中microCLIP算法R语言开发的独立框架，可用于识别转录组范围的miRNA-靶标相互作用。可用于AGO-PAR-CLIP测序读取，需要SAM / BAM比对文件和miRNA列表作为最小输入。microCLIP结合了深度学习分类器，用于CLIP指导的miRNA相互作用检测，为每个候选miRNA识别元件（MRE）和各自的AGO结合的富集区域/簇提取相应特征，随后通过多层分类方案对MRE网站进行评分。 该算法的输出是一个包含（非）经典miRNA相互作用的类BED文件。

microRNA靶标数据库TarBase v7.0

TarBase v7.0是实验支持的microRNA靶标数据库，也是最大的可用手动管理目标数据库，索引了65,000多种miRNA-基因相互作用，是其他任何可用实现的16.5-175倍。该数据库包括源自特定实验以及高通量实验的目标，例如微阵列和蛋白质组学。特别注意包括来自测序实验的靶标，例如HITS-CLIP和PAR-CLIP。TarBase托管来自3个CLIP-Seq和12个Degradome-Seq研究的数据，比任何其他可用数据库都要多得多。

microT-CDS是microT算法的第五版。专门针对位于3’-UTR和CDS区域中的一组阳性和阴性miRNA识别元件（MRE）进行了专门培训。与实验蛋白质组学数据相比，DIANA-microT-CDS与以前的版本相比灵敏度显着提高（65％比52％）。该模块不仅可以显示miRNA与靶基因的结合位置，还有物种保守性，甚至连pubmed上有没有相关文章都能自动检索

2.DIANA-mirPath——miRNA和信号通路

DIANA-mirPath是一个miRNA途径分析网络服务器。该模块可以利用DIANA-microT-CDS算法提供的预测的miRNA靶标（CDS或3’-UTR区域），同时还可以利用DIANA-TarBase衍生的经过实验验证的miRNA进行相互作用分析，随后能够与复杂的合并和元分析算法组合。DIANA-mirPath能够根据多条miRNA来预测信号通路，我们以示例数据进行演示：

3.LncBase——lncRNA-miRNA结合关系
进入该模块，可以发现，该数据库预测可以有两种方式来看lncRNA和miRNA是否有结合可能性，分别是基于实验基础的“Exprimental module”和纯预测的“Prediction module”。

lncRNA的基因组注释信息时，也没关系，只要在开始的界面进入“Search by location”即可，输入具体的位置信息。当我们想看看某个miRNA有哪些可能结合的lncRNA时，只要输入miRNA名字即可。当我们输入一个miRNA后，下面即显示了可能结合的所有lncRNA信息，包括lncRNA注释信息，miRNA的序列信息，有哪些“binding category”，以及具体的结合位置信息都可以看到。可以通过设置Threshold值来进行进一步筛选。
并且该模块不仅显示预测到的lncRNA，还有lncRNA与miRNA的直接结合序列，以及物种保守性和组织、细胞表达。另外预测到的lncRNA还能连接到UCSC数据库：

4.mirPub——miRNA相关文章
Diana mirPub是一个数据库和相关的Web应用程序，能够搜索与特定microRNA分子有关的出版物的研究人员提供了强大而直观的界面。mirPub还提供了有关这些microRNA与任何疾病，组织和基因的相关性的有用信息。 通过考虑microRNA家族和microRNA命名法的历史，它有助于出版物搜索。我们以hsa-mir-22为例进行检索，不仅有文章基本信息，还能根据关键词、疾病、出现位置进行筛选。

5.miRGen——miRNA启动子、调节因子和转录因子
不仅可以通过组织和细胞类型，启动子范围进行筛选，还显示转录因子与miRNA启动子的结合位点、位置。同时可以根据组织、细胞、实验方法、（正、负）相关性、直接还是间接作用和物种进行筛选，还可以获知miRNA的相关疾病。

6.MR-microT——新miRNA靶基因预测
MR-microT是基于MapReduce的microT目标预测方法的实现，该服务器包含对四种物种的预测，并支持miRBase和Ensembl，同时可以支持不同的预测算法并利用高通量实验数据。最重要的是该模块提供了定制miRNA序列的近实时预测。通过这个模块我们可以分析自己和别人的测序数据。

7.mirExTra——分析microRNA功能的表达数据
DIANA-mirExTra可以根据基因3’UTR序列中六个核苷酸长的基序（六聚体）的频率，识别微RNA对蛋白质编码转录本表达水平的影响。发现在条件之间起关键作用的microRNA，并使用DIANA-miRextra v2.0分析来自NGS实验的microRNA / mRNA表达数据。该服务器可通过易于使用的在线界面进行复杂的分析，而无需HPC基础架构的生物信息学专业知识。

还是要再三和大家强调！如果使用了相应数据库的分析结果，一定要记得引用相关数据库的参考文献哦。好了，总之DIANA Tools是一个非常强大的miRNA综合库，并且最新的DIANA Web服务器已完全重新设计，该服务器v5.0对最新的Ensembl（v.69），miRBase版本（miRBase 18）和命名法进行统一，同时保持与选定工具（例如DIANA-TarBase）的所有旧版本的miRBase的兼容性。更多的分析方法还需要小伙伴们动手挖掘哦~

miRWalk数据库

miRwalk:搞定 miRNA 靶点预测及验证的宝藏网站 今天给大家分享的是 miRwalk 数据库，引文来自知乎(生信风暴)
miRWalk(http:// mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/ )是一个综合性的 miRNA 靶
基因数据库，收录了 Human、Mouse、Rat、Dog、cow 等多个物种的
miRNA 靶基因信息，不仅仅记录了基因全长序列上的 miRNA 结合位点，
也会将其与已有的 12 个 miRNA 靶标预测程序(DIANA-microTv4.0 , DIANA-microT-CDS , miRanda-rel2010 , mirBridge , miRDB4.0 ,
miRmap , miRNAMap, doRiNA i.e.,PicTar2, PITA RNA22v2 , RNAhybrid2.1 and Targetscan6.2 )的预测结合信息集合进行结合关联。
数据库一直在更新收录新的资料，第一版是在 2011 年发布，之后在 2015 年发布 V2 版本，并登上了 Nature methods 杂志，目前更新到 V3 版本。
miRwalk 目前有三个版本，都能正常使用，今天所要介绍的是最新版本 3.0:

今天的午间分享是细胞外循环非编码RNA数据库：miRandola——挑圈联靠

miRNA下游靶基因预测数据库

今天与大家分享几种常见的miRNA下游靶基因预测数据库。

之前我们提到了数据库的预测结果只能作为参考哇，一方面可以帮助我们挖掘潜在的分子，另一方面可以用于指导我们后续的湿实验验证。

在训练营中，我们大大小小的为大家分享了十几种数据库，为的就是帮助咱们在不做实验的时候让预测的结果更可靠，能做的方向越精致。指哪打哪才能省下不少功夫呐。

miRNA下游靶基因预测常见的数据库有TargetScan、miRBase、miRwalk、miRanda（假阳性较多）、miRbase Tracker等等。

一般来说生物信息学方法的原则有miRNA与靶基因的互补性、miRNA靶位点的保守性、miRNA-mRNA双链之间的热稳定性、miRNA靶位点不会有复杂的二级结构等。

在实验验证的时候可以由mRNA水平寻找靶基因，比如说过表达miRNA然后进行芯片分析或者是用软件预测；也可以从蛋白水平寻找靶基因，比如可以用到CLIP-seq等，操作稍微有些复杂啦。

下面我们以targetscan、miRanda这两个常用的数据库为例与大家一起看看它的页面吧。

网址是这样哒：http://www.targetscan.org/vert_71/
选择物种：

进入页面：点击对应miRNA查看物种保守区

查询所有miRNA：
所有miRNA列表：
白色高亮为保守种子区
详细信息

http://www.microrna.org/
根据靶基因筛选miRNA：
得出所有miRNA：

根据miRNA筛选靶基因：
得到靶基因：
点击进入：

还有更多数据库大家可以自己去尝试呀。在挑圈联靠公众号上也有很多分享推文哦。大家可以去搜搜哇。在解螺旋官网的科研技能单元课中也有相关的数据库使用详情介绍哦。

细胞信号通路详解之HIF1α通路

iHypoxia数据库

今天和大家分享的是iHypoxia，网址为：http://ihypoxia.omicsbio.info/。整理于解螺旋公众号。该数据库由郑州大学程涵教授、王振龙教授和中山大学刘泽先教授课题组联合开发。iHypoxia共包含有390个条件下，发生在5种哺乳动物的41482个缺氧调节蛋白的158615个量化事件。
进入网站主页后，可以看到网站主页长这个样子。主要功能模块为Browse和Search模块。主页下方也提供搜索和Search模块的功能一致，大家可以通过输入Ensembl ID、UniProt ID、Gene name或Protein name来进行搜索。
我们就拿网页提供的例子来看看iHypoxia能为我们做什么吧。点击例子后Submit，会在下方跳转出搜索结果。
再点击More那一列下的跳转按钮，然后就会跳转出来显示结果，内容包括该基因的基本信息、功能和氨基酸序列。然后有低通量实验的证据，包括实验条件，该基因的表达调节、样本类型和证据水平以及实验的方法。
然后还有高通量实验的证据，内容也和上面基本一致，多了Log2 Ratio和统计显著性。
然后网页给我们展示了该蛋白的翻译后修饰，包括泛素化、乙酰化、羟基化、甲基化、磷酸化、sumo化和糖基化。点击上面不同的图例，可以显示或者关闭该修饰的显示结果。
最后网站还显示了蛋白互作网络和亚细胞定位以及药靶关系。
Browse模块则展示了低通量和高通量实验证据的概括和浏览，大家可以通过点击More下面的跳转按钮浏览相关结果。