货号 | 名称 | 规格 |
BDAA0165 | Polymer HRP Goat Anti Mouse IgG(H+L),Ready to Use | 3ml/10ml/100ml |
BDAA0166 | Polymer HRP Goat Anti Rabbit IgG(H+L),Ready to Use | 3ml/10ml/100ml |
BDAA0167 | Polymer HRP Goat Anti Mouse/Rabbit IgG(H+L),Ready to Use | 3ml/10ml/100ml |
免疫组化(IHC)是利用抗体抗原相互结合的原理,使用带荧光的抗体检测组织切片中的蛋白质或是对抗原进行定位,通过有色酶底物显色检测或荧光染料荧光检测进行观察。
无论使用何种具体方法,该技术的第一步是一抗与其特异性靶标的选择性结合。然后,这种相互作用可以直接或间接地通过不同标记可视化,IHC二抗根据标记方法的不同可以分为以下五类:
间接法,二抗选择的是常规的酶标抗体,常用的标记酶是HRP,如【HRP-山羊抗兔IgG(H+L) #BF03008】
Figure 1. Indirect immunostaining method.
这类二抗的价格较为低廉,且为实验室常备基础试剂,较容易获取。
但是对于低丰度的蛋白,灵敏度低,结合效果较差。
PAP法,又称为过氧化物酶-抗过氧化物酶法。在孵育了二抗后,利用IgG的二价特性,再孵育一种能结合HRP的第三层报告抗体(PAP复合物(过氧化物酶--抗过氧化物酶抗体复合物))。
Figure 2. Two- (a) and three-step (b) bridge immunostaining methods.
PAP法相比于间接法,因为每个抗原位点定位了几个酶分子,因此提高了灵敏度,据报道,PAP法的灵敏度比两步间接法高出近100至1000倍。
但同时该方法也存在也提高了步骤繁琐、特异性抗体与PAP复合物的抗酶抗体必须为同源动物(同一种属动物)、多层检测抗体可能会增加与组织抗原非特异性相互作用的风险。
ABC(SABC)法,又称为亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法。采用此方法的二抗上会标记生物素,加入的由亲和素以及标记了HRP的生物素组成ABC复合物与二抗结合,来进行信号的放大。
Figure 3.Avidin/streptavidin immunostaining method.
这种方法的优点是由于亲和素四聚体可以结合四种生物素复合物,可形成含有几种报告酶的更大的ABC复合物,导致抗原位点的信号强烈放大,从而能够成倍提高灵敏度。
但是,除了同样含有实验流程较长的缺点外,还需考虑,大的ABC结构可能难以在组织中有效扩散,内源性生物素的存在是背景的主要来源,因此需要内源生物素的封闭。此外,凭借其高等电点(pI=10),亲和素带正电,可以结合带负电的分子(例如核酸),它的碳水化合物部分可以与其他分子如凝集素相互作用,但这个问题可以通过下面的LSAB方法进行克服。
LSAB(SP)法,又称为生物素与链霉亲和素法。这种方法的主要区别在于它使用链霉亲和素而不是亲和素,使用HRP标记的链霉亲和素,与生物素化的二抗结合。
Figure 4. LAB/LSAB (a) and BRAB (b) immunostaining methods.
与亲和素相比,链霉亲和素没有会产生非特异性吸附的糖基,从而消除了与凝集素样分子的非特异性相互作用,并且它具有中性pI,从而降低了静电结合的风险。因此,LSAB方法减少了部分背景染色问题,其灵敏度据报道是ABC方法的十倍。
但与ABC法类似,LSAB方法在实验过程中同样需要进行内源生物素封闭,流程较为繁琐。
博奥龙Biodragon Polymer IHC 二抗,即克服了以上问题,同时又能满足高灵敏度的需求
Polymer法,不同于使用生物素-亲和素放大型号的方法,通过二抗-聚合物-酶的复合物与一抗结合,达到荧光定位的效果。
Figure 5. Polymer-based immunostaining method
基于聚合物共价连接的方式,利用与抗体和酶相连的聚合物链,大大增加了酶的数量,从而增加了组织上特定抗原附近的荧光强度。二抗上的聚合物都是性质较为稳定的物质,如葡聚糖,纤维素等,在天然条件下不易降解,酸碱耐受范围较广。
早期的Polymer抗体使用过程中,一些用户进行IHC实验时偶尔会出现检测灵敏度低的情况,这种情况可归因于大分子聚合物分子间的空间位阻,空间位阻阻碍了抗体与组织之间的结合效果。为了解决这个空间障碍的问题,已经开发了紧凑的聚合物复合体来减少空间位阻,使组织更容易被酶标物渗透。
此外,由于聚合物系统不需要生物素,亲和素的使用,因此避免了由内源性生物素表达引起的非特异性背景染色,相比ABC法和LSAB法,实验流程和周期也简单化了,缩短了。
间接法 | PAP法 | ABC法 | LSAB法 | Polymer法 | |
优点 | 操作简单,价格低 | 灵敏度较高无需偶联 | 灵敏度高 | 灵敏度高 | 灵敏度高,操作简单 |
缺点 | 灵敏度低 | 操作繁琐非特异性结合风险 | 操作繁琐非特异性结合风险 | 操作繁琐 非特异性结合风险 | 价格相对较高 |