答疑时刻| 分子克隆新趋势-闪电克隆试剂盒

A：最近在干嘛？怎么天天早出晚归的？

B：在做分子克隆，我身心俱疲啊。

A：我们不是差不多时间开始的吗？我的都做完了，你怎么还在做这一步？

B：你怎么办到的？我设计酶切位点就废了好久，测序发现失败，一周白费又得重来~

A：你不会还在用传统方法吧？我最近都改用博奥龙闪电克隆试剂盒了，速度快到飞起。
B：？？？？没听说过，介绍介绍。

分子克隆是进行生物学研究的基础，在各个领域均有具有广泛的应用。

目前分子克隆连接方式主要有两种，一种是T4 DNA酶连接法，另一种是同源重组法。

T4 DNA酶连接法：在酶切体系内，T4 DNA连接酶通过催化相邻3′-羟基和5′-磷酸末端之间的单链或在双链断裂处形成磷酸二酯键，将目的片段与载体进行连接。如果是黏性末端，由于分子间氢键的作用，片段插入载体内是有方向性的。

同源重组法（又被称为无缝克隆法）：是通过设计带有同源臂的目的片段，通过重组酶的体系，插入线性化质粒。相较于酶连接法，同源重组法通过简单的体外一步同源重组方法实现DNA克隆。

博奥龙公司提供的闪电克隆试剂盒，是基于同源重组法，进行体外分子克隆，一步到位，方便高效快捷。

1. 彻底摆脱限制性内切酶的限制

在使用传统酶切克隆方法时，必须要选择合适的酶切位点，对载体和目的片段进行酶切。酶切位点的选择需注意以下基础原则：

从载体的多克隆位点（multiple cloning site, MCS）区域选择常用的/常见的酶切位点。

确保该位点不存在于目的基因序列中，否则后续会破坏目的基因完整性。

为避免自连，建议优先考虑双酶切，而非单酶切：

若进行单酶切，需要进行去磷酸化处理，以防止末端自连。

双酶切处理需要选择两个不同的酶切位点。这两个酶切位点最好不是同尾酶，否则会产生和单酶切一样的自连现象。双酶切选择的酶切位点相互之间不宜距离太近，两个酶切位点之间至少要有几个碱基间隔（10bp以上）,否则会影响限制性内切酶对切点的识别，导致内切酶在酶切时效率偏低。双酶切需要内切酶在同一缓冲液中都具有最佳的活性。

优先选择可获得的黏性末端，而非平末端的限制性内切酶，平末端载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。

而在使用闪电克隆试剂盒时，则完全无需考虑以上问题。

可以使用任何自备的适当载体，选择最佳的酶切位点，单酶切或双酶切获得的线性化载体均可。甚至无需酶切，直接通过PCR方法实现载体的线性化。

目的片段引物设计上注意插入载体质粒同源区（约15bp）即可。

2. 多个片段可同时插入。

传统方法受酶切位点限制，一次只建议将一个DNA片段插入载体。同时，由于酶切位点之间存在着一定的空间距离，片段与片段之间不可避免地会产生间隔，或者说“缝隙”。

闪电克隆试剂盒允许同时插入多个DNA片段（1-10个）。由于片段和载体之间的连接依靠同源臂，不同的目的基因片段可以按照顺序设计不同的同源臂。在进行连接的时候，重组酶会依次进行连接，所以保证了片段的顺序和方向。

3. 100-200kb的超大片段克隆也能高效完成

传统克隆，片段长度超过6 kb，连接效率就会下降。

闪电克隆试剂盒内的重组酶体系活性较高，即使目的片段有100-200kb，在高保真酶的作用下，也可以进行分子克隆。

4. 克隆片段之间既可无缝衔接，也可任意加入碱基或定点突变

闪电克隆利用基因重组技术，设置同源臂，不需要加上酶切位点序列和碱基保护序列。因此整个过程不会引入额外的碱基，也可以实现一步完成多个片段连续组装。

闪电克隆试剂盒可以使基因定点突变变得简单。无论是进行单点或者多点突变，只需要设计一对引物，进行PCR扩增，替换掉野生型基因的突变位点碱基。突变引物长度为25~45bp, 以突变的碱基为中心, 两边各自加上一段约10–15bp序列。在重组酶的作用下，带突变的引物会替换原有质粒的片段。得到PCR产物后，加入Dpn I去除野生型即可。

5.整个流程时间更短。

传统克隆为保证连接效率，通常需要在16℃条件下过夜连接。

闪电克隆试剂盒连接反应只需10-30分钟。

货号	名称	规格
BDIT0014-25	闪电克隆试剂盒	25次
BDIT0014-50	闪电克隆试剂盒	50次
BDIT0014-100	闪电克隆试剂盒	100次