A:最近在干嘛?怎么天天早出晚归的?
B:在做分子克隆,我身心俱疲啊。
A:我们不是差不多时间开始的吗?我的都做完了,你怎么还在做这一步?
B:你怎么办到的?我设计酶切位点就废了好久,测序发现失败,一周白费又得重来~
A:你不会还在用传统方法吧?我最近都改用博奥龙闪电克隆试剂盒了,速度快到飞起。
B:????没听说过,介绍介绍。
分子克隆是进行生物学研究的基础,在各个领域均有具有广泛的应用。
目前分子克隆连接方式主要有两种,一种是T4 DNA酶连接法,另一种是同源重组法。
T4 DNA酶连接法:在酶切体系内,T4 DNA连接酶通过催化相邻3′-羟基和5′-磷酸末端之间的单链或在双链断裂处形成磷酸二酯键,将目的片段与载体进行连接。如果是黏性末端,由于分子间氢键的作用,片段插入载体内是有方向性的。
同源重组法(又被称为无缝克隆法):是通过设计带有同源臂的目的片段,通过重组酶的体系,插入线性化质粒。相较于酶连接法,同源重组法通过简单的体外一步同源重组方法实现DNA克隆。
博奥龙公司提供的闪电克隆试剂盒,是基于同源重组法,进行体外分子克隆,一步到位,方便高效快捷。
1. 彻底摆脱限制性内切酶的限制
在使用传统酶切克隆方法时,必须要选择合适的酶切位点,对载体和目的片段进行酶切。酶切位点的选择需注意以下基础原则:
从载体的多克隆位点(multiple cloning site, MCS)区域选择常用的/常见的酶切位点。
确保该位点不存在于目的基因序列中,否则后续会破坏目的基因完整性。
为避免自连,建议优先考虑双酶切,而非单酶切:
若进行单酶切,需要进行去磷酸化处理,以防止末端自连。
双酶切处理需要选择两个不同的酶切位点。这两个酶切位点最好不是同尾酶,否则会产生和单酶切一样的自连现象。双酶切选择的酶切位点相互之间不宜距离太近,两个酶切位点之间至少要有几个碱基间隔(10bp以上),否则会影响限制性内切酶对切点的识别,导致内切酶在酶切时效率偏低。双酶切需要内切酶在同一缓冲液中都具有最佳的活性。
优先选择可获得的黏性末端,而非平末端的限制性内切酶,平末端载体与DNA片段进行连接时,应首先将载体进行去磷酸化处理,以防止其自身环化。
而在使用闪电克隆试剂盒时,则完全无需考虑以上问题。
可以使用任何自备的适当载体,选择最佳的酶切位点,单酶切或双酶切获得的线性化载体均可。甚至无需酶切,直接通过PCR方法实现载体的线性化。
目的片段引物设计上注意插入载体质粒同源区(约15bp)即可。
2. 多个片段可同时插入。
传统方法受酶切位点限制,一次只建议将一个DNA片段插入载体。同时,由于酶切位点之间存在着一定的空间距离,片段与片段之间不可避免地会产生间隔,或者说“缝隙”。
闪电克隆试剂盒允许同时插入多个DNA片段(1-10个)。由于片段和载体之间的连接依靠同源臂,不同的目的基因片段可以按照顺序设计不同的同源臂。在进行连接的时候,重组酶会依次进行连接,所以保证了片段的顺序和方向。
3. 100-200kb的超大片段克隆也能高效完成
传统克隆,片段长度超过6 kb,连接效率就会下降。
闪电克隆试剂盒内的重组酶体系活性较高,即使目的片段有100-200kb,在高保真酶的作用下,也可以进行分子克隆。
4. 克隆片段之间既可无缝衔接,也可任意加入碱基或定点突变
闪电克隆利用基因重组技术,设置同源臂,不需要加上酶切位点序列和碱基保护序列。因此整个过程不会引入额外的碱基,也可以实现一步完成多个片段连续组装。
闪电克隆试剂盒可以使基因定点突变变得简单。无论是进行单点或者多点突变,只需要设计一对引物,进行PCR扩增,替换掉野生型基因的突变位点碱基。突变引物长度为25~45bp, 以突变的碱基为中心, 两边各自加上一段约10–15bp序列。在重组酶的作用下,带突变的引物会替换原有质粒的片段。得到PCR产物后,加入Dpn I去除野生型即可。
5.整个流程时间更短。
传统克隆为保证连接效率,通常需要在16℃条件下过夜连接。
闪电克隆试剂盒连接反应只需10-30分钟。
货号 | 名称 | 规格 |
BDIT0014-25 | 闪电克隆试剂盒 | 25次 |
BDIT0014-50 | 闪电克隆试剂盒 | 50次 |
BDIT0014-100 | 闪电克隆试剂盒 | 100次 |