一键破解WB多条带--Swissprot数据库

WB条带不符合预期？

不要着急扔掉结果，有可能是重要信息忽略了哟！Swissprot带你了解蛋白大小的前因后果。

UniProtKB/Swiss-Prot (reviewed) 是一个高质量人工注释且非冗余的蛋白序列数据库。其中包含各类实验结果、计算得到的特征信息和文献信息等。由于其高质量，它被很多人列为首选数据库之一。

下面会通过几个例子说明下Swissprot数据库在WB中的部分应用：

Q：抗体的说明书上没有写分子量，我裁膜时不知道从哪开始裁。

A：这个问题Swissprot可以给出答案。举个例子：购买了CK20抗体，但是说明书没有写预测分子量，也没有图，这个时候该怎么查蛋白理论值大小？

操作步骤

找到购买抗体公司的官网，打开CK20抗体，找到Swissprot Link/Swissprot No. （如果官网没有，可直接打开Swissprot官网搜索目标蛋白），链接到Swissprot，左边栏点击“Sequence”，根据“Mass (Da) 48,487”可以得出，理论分子量约为48KD，那么在裁膜时根据marker位置流出足够的大小（尽可能大，防止有PTMs，导致条带位置变化，如下文所述情况。）

Q：WB实验结果出现了两条带，到底哪条才是我的目标条带呢？

A：WB实验学会简单，学好难，总会出现各种问题，当出现两条/多条条带时，用Swissprot该怎么判断呢？

通过Swissprot可以判断是否有isoforms存在：

Eg: PCKGM-HUMAN，在Swissprot中搜索，点击“Sequence & Isoforms”发现有3个isoforms存在，除了一个经典序列约为70KD，还有2个分子量大小不一样的isoforms：47KD、56KD（如下图）。如果在目标细胞中表达的是其中任意2个isoforms，在做WB时就有可能出现2条带的现象。

Q：理论值50KD，结果做出来在60KD左右，为什么？

A：有可能是翻译后修饰导致蛋白大小变化的。

• 在翻译后的修饰过程中，可能会导致蛋白质分子量增加，常见修饰如磷酸化、糖基化等。
• 在翻译后的修饰过程中，某些剪切体、成熟体的形成也可能会导致蛋白质分子量减少，例如剪切体、信号肽、泛素化修饰等（如Caspase 3）。

Q：Swissprot其他常用小技巧

确定蛋白的亚细胞定位：在做IHC/IF时，需要确定的一点是目标蛋白的亚细胞定位，以便观察，这个时候就可以在Swissprot中精准定位，具体操作步骤如下：

Eg: CD47-Human

打开Swissprot网站，搜索“CD47”→点击“CD47-HUMAN”→点击“Subcellular Location”，就可以看到CD47定位在细胞膜上。由此，在做蛋白定位实验时就可以有目的的寻找符合要求的细胞了。